新一代NK细胞衔接器平台：整合低活性IL-15变体增强抗肿瘤疗效

《Antibody Therapeutics》：The development of a next generation NK cell engager platform by integrating a potency-reduced IL-15 variant to enhance antitumor activity

本研究针对当前NK细胞衔接器(NKCE)临床疗效有限的问题，开发了一种新型四价IL15v-NKCE平台。研究人员通过将活性降低的IL-15变体(IL15v)整合到基于抗NKp46的NKCE中，实现了对NK细胞的选择性激活，在临床前模型中显示出优越的抗肿瘤活性和良好的安全性，为基于NK细胞的免疫治疗提供了有前景的新一代策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，自然杀伤细胞(NK细胞)因其能够不依赖预先致敏直接识别和清除恶性细胞的独特能力而备受关注。近年来，自然杀伤细胞衔接器(NKCE)的开发已成为利用NK细胞抗肿瘤潜力的重要策略。然而，尽管传统NKCE在临床前研究中显示出良好前景，但其作为单一疗法的临床疗效，特别是在实体瘤中相对有限。

目前NKCE面临的主要挑战包括：肿瘤微环境通过免疫抑制细胞和细胞因子抑制NK细胞功能；免疫检查点和物理屏障限制NK细胞浸润和活性；更重要的是，NK细胞通过传统NKCE与肿瘤细胞结合后可能引发细胞凋亡，从而减弱治疗效果。与此同时，白细胞介素15(IL-15)作为关键的NK细胞激活因子，虽然在促进NK细胞存活、增殖和功能激活方面具有重要作用，但野生型IL-15在临床试验中显示出显著毒性，限制了其治疗应用。

针对这些挑战，上海EpimAb Biotherapeutics的研究团队在《Antibody Therapeutics》上发表了一项创新研究，开发了新一代NK细胞衔接器平台IL15v-NKCE。该平台通过将活性降低的IL-15元素(IL15v)整合到基于抗NKp46的NKCE中，旨在利用IL-15的有益效应同时减轻其相关毒性。

关键技术方法

研究采用多种关键技术方法：通过杂交瘤技术生成抗NKp46抗体并进行人源化改造；利用IL-15报告基因检测评估IL-15变体活性；通过pSTAT5流式细胞术分析NK细胞和T细胞激活；建立NK细胞与肿瘤细胞共培养体系评估体外细胞毒性；使用B16F10-HER2同基因模型和NCI-N87异种移植模型进行体内疗效评价；通过体重监测、肝酶水平和淋巴细胞计数评估安全性。所有实验均使用商业化来源的人外周血单核细胞(PBMC)和小鼠模型。

研究结果

1. 基于抗NKp46的NKCE的生成和表征

研究人员通过用NKp46胞外结构域重组蛋白免疫小鼠，获得了10个对人和食蟹猴NKp46均呈阳性的杂交瘤克隆。将这些克隆的V_H和V_K基因与含L234A L235A(LALA)突变的人IgG1重链恒定结构域和人kappa恒定结构域配对，成功生成嵌合单克隆抗体。

plate-bound单克隆抗体均能通过诱导CD107a上调激活NK细胞。四个嵌合单克隆抗体(EM1010-03c、-04c、-06c和-14c)通过将互补决定区(CDR)移植到人类种系序列框架中进行人源化，获得的人源化抗体显示出与人和食蟹猴NKp46相当的结合活性和NK细胞激活能力。NKCE采用1+1设计，包含曲妥珠单抗衍生的靶向HER2的Fab片段和靶向NKp46的单链抗体片段(scFv)，融合到同源二聚化人IgG1 Fc的N末端。NKp46 × HER2 NKCE在体外共培养实验中引发NK细胞对HER2表达SK-BR-3肿瘤细胞的细胞毒性，并在人NKp46转基因SCID小鼠的异种移植NCI-N87肿瘤模型中显示出体内抗肿瘤功效。

2. 设计降低IL-15活性的IL15v用于IL15v-NKCE开发

为获得活性降低的IL-15，研究人员设计了各种突变的IL-15与IL-15Rα寿司结构域复合物，并通过柔性"GGGGSGGGGS"连接子融合到人IgG1 Fc结构域。构建含单氨基酸取代(D61A、E64A、N65A、I68A、L69A和N72A)的IL-15变体，并融合到Fc结构域的N末端。

IL-15报告基因检测结果表明，N65A突变导致最显著的效能降低。当IL-15/寿司结构域复合物融合到Fc结构域的C末端时，活性进一步降低。C末端融合的IL-15(N65A)/寿司复合物产生协同性IL-15活性降低。最终确定的IL15v组件包含IL-15突变变体(N65A)与寿司结构域的复合物，通过2×(G₄S)肽连接子融合到Fc区域的C末端。

3. IL15v-NKCE平台的开发和体外表征

IL15v-NKCE通过将IL15v组件整合到上述NKCE格式中开发而成。为验证作用机制，研究人员设计了一系列构建体：含野生型Fc的IL15v-NKCE-HER2、含LALA突变沉默Fc的IL15v-NKCE-HER2(Fc null)，以及含野生型Fc和替换抗NKp46靶向臂的无关scFv的IL15v-NKCE-HER2(NKp46 null)。

研究结果显示，在缺乏HER2抗原的情况下，IL15v或NKCE-HER2单独均不能激活NK细胞。而在IL15v-NKCE结构中，野生型Fc和抗NKp46组件独立恢复了IL-15活性，两者组合产生对NK细胞IL-15活性的最大恢复。重要的是，与野生型IL-15和NKCE-HER2组合相比，IL15v-NKCE-HER2在激活NK细胞方面效能降低，且对CD4⁺和CD8⁺ T细胞刺激作用极小。细胞因子释放检测表明，在缺乏肿瘤相关抗原(TAA)情况下，IL15v-NKCE细胞因子释放风险较低。

在存在肿瘤细胞情况下，IL15v-NKCE-HER2诱导的NK细胞脱颗粒显著高于NKCE-HER2，且这种增强需要靶细胞存在。IL15v-NKCE-HER2在存在和缺乏肿瘤细胞情况下均促进NK细胞增殖，但程度低于野生型IL-15。

4. IL15v-NKCE在体外相比NKCE表现出更强效性

研究人员生成靶向不同TAA(包括HER2、Trop2和CD123)的多个分子。体外杀伤实验显示，与亲本NKCE相比，IL15v-NKCE在所有测试的TAA表达肿瘤细胞中均引发显著增强的肿瘤细胞毒性。与现有NKCE平台(TriNKET和ANKET)的代表性产品比较表明，IL15v-NKCE可能成为最佳NKCE平台。

5. 体内表征显示IL15v-NKCE具有优化设计，增强疗效并改善安全性

在野生型C57BL/6小鼠中，野生型IL-15和IL15v-NKCE-HER2均显示剂量依赖性肿瘤生长抑制，但IL-15给药引起显著体重减轻、肝毒性指标升高和外周血淋巴细胞扩张。相比之下，IL15v-NKCE-HER2在高达10 mg/kg剂量下未产生类似IL-15的不良反应，同时实现完全肿瘤消除。

对照分子研究显示，去除IL15v元素导致抗肿瘤活性显著降低，而消除TAA结合或功能性Fc则导致肿瘤抑制完全丧失，表明IL15v元素需要与功能性Fc和TAA结合协同发挥作用。

在hNKp46转基因C57BL/6小鼠和hNKp46转基因SCID小鼠模型中，IL15v-NKCE-HER2在高达10 mg/kg剂量下未引起体重减轻，且表现出显著抗肿瘤活性，而NKCE-HER2治疗对已建立肿瘤无抗肿瘤效果。更重要的是，IL15v-NKCE-HER2与抗PD-1抗体联合治疗相比NKCE与抗PD-1抗体联合产生更高的完全缓解率。

研究结论与意义

本研究开发的IL15v-NKCE平台通过整合活性降低的IL-15元素，代表NK细胞衔接疗法的重要进展。该平台创新性地通过位阻效应结合点氨基酸突变显著降低IL-15活性，同时通过NKp46和Fc受体结合恢复IL15v在NK细胞上的效能。这种设计使IL15v-NKCE能够选择性靶向NK细胞而不激活T细胞，在临床前模型中显示出优于传统NKCE的抗肿瘤效果和更宽的治疗窗口。

重要的是，该研究为靶向具有广泛正常组织表达的肿瘤相关抗原提供了新思路。例如，CD123在正常造血和髓系细胞上广泛表达，靶向CD123的抗体药物偶联物(ADC)和T细胞衔接器(TCE)开发面临重大血液学毒性风险。而靶向CD123的NKCE IPH6101/SAR443579已显示出良好前景，表明NKCE可能为TCE和ADC开发困难的TAA提供可行选择。

然而，小鼠模型在评估IL-15安全性方面存在局限性，需要在非人灵长类动物中进一步评估安全性。此外，IL15v-NKCE处理的人PBMC中观察到非常轻微的NK细胞增殖，也需要进一步研究。

总体而言，IL15v-NKCE的开发为基于NK细胞的免疫治疗提供了有前景的新策略，具有重要的临床转化潜力。该平台不仅解决了传统NKCE疗效有限的问题，同时通过精巧的分子设计成功规避了IL-15相关毒性挑战，为下一代癌症免疫治疗的发展开辟了新方向。