靶向宏基因组学通过探针捕获技术显著提升复杂微生物群落中氮循环和甲烷循环功能基因的多样性检测

《ISME Communications》：Targeted metagenomics using probe capture detect a larger diversity of nitrogen and methane cycling genes in complex microbial communities than traditional metagenomics

本研究针对传统宏基因组学在复杂微生物群落中难以检测低丰度功能基因的局限，开发了一种基于探针杂交捕获的靶向宏基因组学方法。研究人员针对14个参与无机氮(N)和甲烷(CH4)循环的关键功能基因，设计了包含264,111条独特探针的文库。结果表明，该方法在模拟群落中能准确还原基因丰度，在农业和湿地土壤样本中，相较于鸟枪法宏基因组学和PCR扩增子测序，能检测到更高的功能基因多样性（例如古菌amoA基因多样性分别提高28倍和1.24倍）。此技术为深入表征生物地球化学循环中的关键微生物功能群提供了强大工具。

　　

微生物是地球生物圈的关键引擎，默默驱动着全球氮(N)和碳(C)循环，调控着营养元素的可用性、通量，以及强效温室气体一氧化二氮(N₂O)和甲烷(CH₄)的排放。然而，这些承担重要功能的微生物类群在土壤、沉积物和水生生态系统中通常只占微生物群落的很小一部分。传统的16S rRNA基因测序无法准确揭示其功能，而鸟枪法宏基因组学在测序深度有限的情况下，也难以捕捉到这些低丰度功能基因的完整多样性。另一方面，基于PCR的功能基因扩增子测序又受限于引物的覆盖范围，难以捕获未知或高度多样的基因变异，并且容易产生嵌合体等偏差。因此，如何精准、高效地解析复杂环境中参与关键生物地球化学循环的微生物功能群，成为了微生物生态学领域的一个突出挑战。

为了解决这一问题，由Henri M.P. Siljanen领衔的研究团队在《ISME Communications》上发表了一项研究，他们开发并评估了一种名为“靶向宏基因组学”的新方法。这种方法像一把高精度的“基因鱼叉”，能够从复杂的微生物基因组“海洋”中，特异性地“钓取”与研究目标相关的基因序列。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：1) 利用隐马尔可夫模型（HMM）从公共数据库（NCBI nt/envnt, Fungene）中搜集并构建了14个氮循环和甲烷循环关键功能基因的目标基因数据库（TDB）；2) 使用MetCap生物信息学流程，基于TDB（以80%相似性聚类）设计了包含263,111条50-mer特异性探针的文库，并通过NimbleGen SeqCap EZ（Roche）合成；3) 对模拟群落（包含18种已知微生物的DNA混合物）和两种环境样本（匈牙利农业土壤和法国湿地土壤）的DNA进行文库构建，随后进行探针杂交捕获，并使用Illumina MiSeq平台进行测序；4) 利用HMMER、DIAMOND等工具对产生的序列进行功能注释和分类学分析，并与传统的鸟枪法宏基因组学和PCR扩增子测序（以古菌amoA基因为例）结果进行比较。

模拟群落验证靶向宏基因组学的准确性与定量能力

研究首先通过模拟微生物群落来验证新方法的可靠性。研究人员将包含14个靶标功能基因的18种细菌和古菌的基因组DNA按不同比例混合，构成了六组具有不同加权GC含量（47%至63%）的模拟群落。分析结果显示，靶向宏基因组学检测到的功能基因相对丰度与模拟群落中预设的基因丰度高度相关（r=0.78, P<0.0001）。这表明该方法能够准确定量目标基因。

不过，研究也发现GC含量对探针效率有轻微影响，低GC含量的目标（如某些硝化菌的nirK基因）检测效率略低于高GC含量目标。此外，自定义HMM模型对目标基因识别的精确度（Precision）很高，平均值达到93.4%（中位数99.8%），召回率（Recall）则在42.8%到100%之间。

靶向宏基因组学在复杂环境样本中展现出强大优势

研究人员将靶向宏基因组学应用于真实的农业土壤和湿地土壤样本，并与测序数据量高出近百倍的传统鸟枪法宏基因组学结果进行比较。尽管测序深度差异巨大，靶向方法在两种环境中均检测到了更多的目标基因序列（最多高出60倍）。两种方法测得的基因相对丰度显著相关（农业土壤R=0.96, 湿地土壤R=0.70），表明靶向方法在极大提高检测灵敏度的同时，并未引入显著的定量偏差。两种生态系统中功能基因的相对丰度差异也符合其环境特征，例如，湿地土壤中固氮基因（nifH）和产甲烷基因（mcrA）更丰富，而农业土壤中与氨氧化（amoA）和反硝化（nirS, norB, nosZ）相关的基因更占优势。

靶向方法捕获更高的功能基因多样性

为了比较不同方法在揭示基因多样性方面的能力，研究人员以古菌氨单加氧酶基因（archaeal amoA）和氧化亚氮还原酶基因（nosZ）作为案例进行了深入分析。结果显示，靶向宏基因组学检测到的古菌amoA基因分类单元（Taxonomic Bins）数量（71-83个）远高于鸟枪法宏基因组学（仅3个），也略高于PCR扩增子测序（65-68个）。稀释曲线分析表明，靶向方法能以更少的测序量更快地达到多样性饱和，揭示了更高的α多样性（分别是鸟枪法的28倍，扩增子测序的1.24倍）。

对于nosZ基因，靶向方法同样检测到远高于鸟枪法的序列多样性（约6800个分类单元 vs. 约1300个分类单元，以90%一致性为阈值），并且捕获到了更多属于研究较少的Clade II类群的新颖序列变异。

研究结论与意义

本研究成功开发并验证了一套用于研究无机氮和甲烷循环微生物功能群的靶向宏基因组学方法。该方法的核心优势在于：1) 高灵敏度：能够高效富集低丰度的功能基因，克服了鸟枪法宏基因组学在复杂样本中测序深度不足的瓶颈；2) 高多样性捕获能力：通过设计大量探针覆盖广泛的序列空间，能够检测到比PCR扩增子测序更多、尤其是更新颖的基因变异；3) 多重并行分析：无需进行多次独立的PCR反应，即可同时、定量地分析多个功能基因，提供了对微生物生态系统功能的整体视图；4) 定量可靠性：在模拟群落和自然环境中均显示出与预期或传统方法良好的定量相关性。

尽管探针设计需注意低GC含量基因的覆盖问题，且其效果依赖于背景数据库的完整性，但靶向宏基因组学无疑为在复杂环境中深入探索关键微生物功能群，特别是那些稀有或未被培养的类群，提供了一个强大而经济高效的解决方案。它有效地弥补了鸟枪法宏基因组学和PCR扩增子测序之间的技术空白，有望在未来的微生物生态学、环境科学和全球变化研究中发挥重要作用，帮助科学家更清晰地揭示微生物驱动的地球化学过程及其对生态系统功能的贡献。