基于离线二维液相色谱-质谱联用技术的人尿液非靶向代谢组学分析方法比较研究

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Comparative evaluation of comprehensive offline 2D-LC strategies coupled to MS for untargeted metabolomic studies of human urine

本研究针对代谢组学分析中单维液相色谱覆盖度有限的问题，系统评估了离线全二维液相色谱（LC×LC）与质谱联用策略。通过比较混合模式RP/IEX×HILIC组合与常规LC-MS方法，发现直接进样5μL未处理组分可最大程度保留代谢物特征，为生物标志物鉴定提供了优化方案。

　　

在生命科学领域，代谢组学作为研究生物体内小分子代谢物的关键技术，已成为疾病诊断、药物开发等重要方向的支撑工具。然而面对人体代谢组可能高达500万种化合物的复杂性，传统分析技术犹如“大海捞针”——据估算，目前最常用的反相液相色谱（RP-LC）仅能覆盖5%-10%的疏水性代谢物，而占代谢组绝大部分的极性化合物则因在反相色谱中无法保留而难以检测。这种技术瓶颈使得科学家们不断探索更高效的分析策略。

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》近期发表的研究论文，聚焦于解决代谢组学分析中的覆盖度难题。团队前期研究发现，混合模式色谱（同时具备反相和离子交换功能）与亲水相互作用色谱（HILIC）的组合可实现最宽泛的代谢物分布。基于此，本研究构建了离线全二维液相色谱-飞行时间质谱（LC×LC-TOF-MS）平台，首次系统评估了RP/IEX×HILIC组合在非靶向代谢组学中的性能。

研究团队通过四方面关键技术开展系统验证：首先采用标准品评估HILIC维度进样体积（0.5-10μL）对峰形的影响；其次比较不同组分处理方式（直接进样、乙腈稀释、氮吹浓缩至1/3体积、干燥重建）对23种目标物峰面积的改变；进而以人尿液为样本，对比直接进样质谱（DFI）、一维HILIC分离、离线二维色谱不同处理方案及串连色谱等七种策略的特征检测数；最后通过xcms软件包进行峰检测与对齐，结合热图和维恩图分析数据重叠度。

HILIC进样条件优化实验

通过早期洗脱化合物7-甲基黄嘌呤和晚期洗脱化合物N-乙酰天冬氨酸的对比发现，5μL进样量可平衡峰形保持与检测灵敏度需求。当进样溶剂水比例超过60%时，10μL进样会导致早期洗脱物峰分裂，而5μL进样在所有水比例下均保持稳定，最终被确定为最佳进样体积。

组分处理方式的靶向评估

稀释处理使峰面积平均提高1.27倍，浓缩和干燥重建分别提高2.33倍和2.28倍。但干燥处理出现显著差异性：色氨酸峰面积增加5.91倍，而部分化合物反而降低至0.47倍，提示干燥过程可能导致降解或吸附损失。热图分析显示化合物响应变化形成三个聚类，证实处理效果与化合物性质密切相关。

非靶向策略特征数比较

离线二维色谱直接进样（C方案）在正负离子模式下分别检测到2864和2598个特征，显著高于一维HILIC（1350/476个）和直接进样质谱（119/134个）。干燥重建方案（F方案）虽特征数最高（4001/3440个），但维恩图显示其独有特征占比达19%，远高于其他方案（3%-12%），暗示可能产生人工假峰。串连色谱因硬件限制导致峰形畸变，仅检测到768个特征。

研究结论与意义

本研究证实RP/IEX×HILIC二维色谱系统可显著提升代谢物检测覆盖度，其成功关键在于二维分离空间的互补性。通过系统评估首次明确：离线处理中的蒸发步骤虽能提高灵敏度，但可能引入假峰且操作繁琐；而直接进样5μL未处理组分方案在特征数、操作效率与结果可靠性间达到最佳平衡。该工作为复杂生物样本的非靶向代谢组学提供了标准化方案，特别适用于尿液生物标志物研究，如咖啡摄入代谢标志物筛选等应用场景。