CliCAR：一种非遗传性CAR工程策略赋能NK细胞用于靶向癌症免疫治疗

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：CliCAR: A non-genetic CAR engineering strategy to empower NK cells for targeted cancer immunotherapy

本文推荐一项创新性研究：为解决病毒载体在NK细胞中转导效率低、易引发先天免疫反应等问题，研究人员开发了非病毒平台CliCAR（重组嵌合抗原受体融合蛋白），通过蛋白直接孵育快速赋予NK细胞CAR样功能。结果表明，CliCAR-NK细胞能特异性杀伤HER2阳性癌细胞并增强免疫激活，体内实验显著抑制肿瘤生长且无毒性。该策略为安全、快速、可定制的"现货型"免疫细胞疗法提供了新途径。

　　

在癌症治疗领域，免疫疗法已成为革命性的突破，其中基于嵌合抗原受体（CAR）的细胞疗法在血液肿瘤中展现出显著疗效。然而，这种基因工程方法面临重大挑战：病毒载体在天然免疫细胞（特别是自然杀伤细胞）中的转导效率低下，且外源核酸易触发先天免疫反应，导致细胞凋亡或功能受损。这成为CAR-NK细胞疗法大规模应用的瓶颈。为了突破这些限制，研究人员另辟蹊径，开发了一种无需基因编辑的全新策略。

这项发表在《Biomedicine》的研究提出了一种名为CliCAR的非病毒平台。研究人员设计了一种重组嵌合抗原受体融合蛋白，能够通过简单孵育快速将NK细胞转化为具有CAR功能的细胞。这种蛋白基方法绕过了基因递送环节，避免了核酸识别引发的免疫应激，为安全、可扩展的"现货型"免疫细胞疗法开发提供了新技术路径。

研究采用了几项关键技术方法：利用Expi293表达系统生产重组CliCAR融合蛋白；通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析蛋白的膜定位及结合特异性；采用实时细胞分析系统动态监测抗癌效果；通过小鼠异种移植模型评估体内疗效。所有细胞系均来自标准细胞库，动物实验使用NSG小鼠模型。

3.1. 靶向免疫治疗示意图

研究人员设计了包含HER2靶向域、跨膜域和胞内共刺激域的三结构域融合蛋白，通过直接与NK细胞孵育实现膜定位，使细胞获得靶向杀伤HER2阳性癌细胞的能力。

3.2. CliCAR融合蛋白表征和细胞毒性分析

蛋白印迹证实成功获得分子量约65.83kDa的重组蛋白。细胞毒性测试显示，CliCAR在高达200μg/mL浓度下对NK细胞无显著毒性，为后续实验提供了安全浓度范围。

3.3. CliCAR-NK细胞生成条件优化

通过时间梯度和浓度梯度实验确定最佳修饰条件：200μg/mL浓度下孵育14小时。温度依赖性实验表明CliCAR通过Tat肽介导的能量依赖性方式内化。

3.4. CliCAR-NK细胞表征和确认

Z堆栈共聚焦成像显示CliCAR蛋白均匀分布于NK细胞膜表面。特异性结合实验证实表面表达的CliCAR能够与HER2蛋白特异性结合，且不影响NK细胞固有表面标志物表达。

3.5. CliCAR-NK细胞体外抗癌效果

CliCAR-NK细胞对HER2阳性癌细胞表现出显著的特异性杀伤作用，且效应呈剂量依赖性。与未修饰NK细胞相比，CliCAR-NK细胞在HER2阳性癌细胞上的滞留率显著提高。

3.6. CliCAR-NK细胞抗癌效果实时监测

阻抗实时分析显示，CliCAR-NK细胞选择性抑制HER2阳性癌细胞生长，而对HER2阴性细胞无显著影响，证实了治疗的特异性。

3.7. CliCAR-NK抗癌效果稳定性验证

CliCAR-NK细胞在生成后72小时内保持稳定的抗原依赖性细胞毒性，功能持久性支持其治疗应用潜力。

3.8. CliCAR-NK细胞抗癌作用机制

与HER2阳性癌细胞共培养后，CliCAR-NK细胞显著提升干扰素-γ、穿孔素和颗粒酶B的分泌水平，表明通过特异性抗原识别激活了细胞毒性通路。

3.9. CliCAR-NK细胞体内抗癌效果

在HER2阳性移植瘤模型中，CliCAR-NK治疗显著抑制肿瘤生长，且呈剂量依赖性，而对HER2阴性肿瘤无显著效果。所有治疗组小鼠均未出现明显体重下降或毒性反应。

研究结论表明，CliCAR系统成功建立了一种蛋白基CAR策略，能够快速、安全地赋予NK细胞抗原特异性功能。这种方法避免了基因编辑的相关风险，支持大规模、可重复的"现货型"免疫细胞疗法生产。讨论部分强调，该平台的模块化设计允许通过简单更换靶向域来适应不同抗原，为应对肿瘤异质性和抗原逃逸提供了灵活策略。这种非遗传性功能化方法为下一代精准免疫治疗的发展开辟了新途径，有望加速CAR细胞疗法的临床转化。

特别是对于实体瘤治疗，CliCAR平台展示出显著优势。传统CAR-T细胞在实体瘤中面临肿瘤微环境抑制和靶向毒性等挑战，而CliCAR-NK细胞结合了NK细胞固有的肿瘤浸润能力和CAR的特异性靶向优势，为实体瘤治疗提供了新思路。研究人员选择HER2作为模型靶点，不仅因为其在乳腺癌等多种实体瘤中高表达，更因为曲妥珠单抗序列的临床验证为治疗安全性提供了保障。

这项研究的创新性在于完全规避了核酸递送环节，从根本上解决了NK细胞对病毒载体敏感的问题。重组蛋白的大规模生产可行性、质量控制相对简便以及可随时使用的特性，使CliCAR平台在产业化方面具有明显优势。未来，通过优化蛋白结构和信号域组合，进一步提高治疗效果和持久性，CliCAR策略有望成为癌症免疫治疗领域的重要补充技术。