高通量T细胞受体克隆技术揭示靶向次要组织相容性抗原的TCR多样性及其功能特性

《Blood Advances》：High throughput cloning reveals diverse properties of T cell receptors targeting minor histocompatibility antigens

本研究针对T细胞受体（TCR）克隆技术难度大、成本高的问题，开发了一种名为“TCXpress”的高通量平台。研究人员利用该技术，从少量血液样本中快速克隆出多个靶向HA-1H和HA-2V次要组织相容性抗原（miHA）的独特TCR，并揭示了其广泛的亲和力范围。该研究为过继性T细胞免疫治疗提供了新的技术方法和丰富的TCR资源，具有重要的临床转化潜力。

　　

在对抗白血病的战场上，异基因干细胞移植（allogeneic stem cell transplantation, alloSCT）是一种强有力的武器。然而，这场战役常常面临一个两难困境：我们期望移植进来的免疫细胞（移植物）能够攻击患者体内残存的白血病细胞（即 graft-versus-leukemia effect, GVL，移植物抗白血病效应），但同时又要避免它们误伤患者的正常组织，引发移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）。有没有一种“精确制导”的武器，能够专门识别并清除白血病细胞，而对正常组织秋毫无犯呢？

科学家们将目光投向了次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigens, miHAs）。这些抗原如同细胞表面的“身份徽章”，由于供者和受者（除主要组织相容性复合体MHC之外）的遗传背景细微差异所致。特别是一些仅存在于造血细胞（包括白血病细胞）上的miHAs，就成了理想的靶点。靶向这类miHAs的CD8⁺ T细胞理论上可以精准地消灭白血病细胞，同时避免攻击不表达这些抗原的正常组织，从而在发挥强大GVL效应的同时，将GVHD的风险降至最低。

然而，将这一美好设想转化为广泛的临床现实，存在一个巨大的技术瓶颈：如何高效、快速地从患者或供者体内分离出那些能够识别miHAs的、具有治疗潜力的T细胞受体（T cell receptor, TCR）？传统的TCR克隆方法依赖于核酸测序和基因合成，过程繁琐、耗时且昂贵，这严重限制了针对不同miHAs的个性化TCR免疫疗法的开发。

为了突破这一瓶颈，来自匹兹堡大学的研究团队在《Blood Advances》上发表了一项研究，他们开发并验证了一种名为“TCXpress”的新型高通量平台。该技术能够绕过传统的测序和合成步骤，直接从单个细胞中快速克隆并功能性表征TCR。利用这一利器，研究人员成功地从健康志愿者和患者体内分离出多株靶向两种重要miHAs（HA-1^H和HA-2^V）的独特TCR，并揭示了这些TCR功能特性的惊人多样性，为过继性T细胞治疗（adoptive T cell immunotherapy）的进一步发展提供了强大的技术支持和宝贵的资源库。

主要关键技术方法

本研究核心是“TCXpress”高通量TCR克隆平台，其特点是无须核酸测序或基因合成即可从单细胞快速克隆TCR。研究样本来源包括：一名因妊娠免疫的HLA-A*02:01 HA-1^R/R健康女性志愿者的外周血，以及一名异基因干细胞移植后复发并接受供者淋巴细胞输注的骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome, MDS）患者的外周血（分别在GVHD发作期和缓解期采集）。技术流程主要包括：利用miHA-抗原肽-MHC（pMHC）多聚体（如dextramer, tetramer）荧光标记分选抗原特异性T细胞，单细胞捕获，基于TCXpress平台的TCR克隆，以及通过转导TCR至报告细胞系来评估TCR的亲和力/功能性。

研究结果

从免疫个体克隆抗HA-1^H TCRs

研究人员首先从一名HLA-A*02:01阳性、但自身基因型为HA-1^R/R（即不表达HA-1^H抗原）的健康女性志愿者体内寻找靶向HA-1^H的TCR。该志愿者因既往妊娠可能接触过HA-1^H抗原而产生免疫。仅从50毫升外周血中，经过体外扩增后，他们成功地从740个HA-1^H-dextramer⁺（即能结合HA-1^H抗原呈递复合物的）细胞中克隆出了20个独特的抗HA-1^H TCR。值得注意的是，整个筛选过程仅用了35天，初步展示了TCXpress平台的高效性。其中，初始直接从血液中克隆出7个，经体外扩增后又获得了13个。

从治疗患者克隆抗HA-2^V TCRs

为了验证该平台在临床治疗情境下的适用性，研究团队转向一名骨髓增生异常综合征患者。该患者在异基因干细胞移植后白血病复发，接受了供者淋巴细胞输注，并且在采样时经历了GVHD的发作与后续缓解。研究人员从该患者体内，分两个时间点采集样本：一是在GVHD发作时（未经过多 manipulation 的样本），二是在GVHD和MDS均达到缓解时。从总共771个HA-2^V-tetramer⁺细胞中，他们成功克隆出了12个独特的抗HA-2^V TCR。具体而言，在GVHD发作期样本中分离到10个，在疾病缓解期样本中分离到8个（部分TCR可能在两个时间点均有发现）。这表明即使在复杂的体内免疫应答背景下，TCXpress平台也能有效地分离出抗原特异性TCR。

抗miHA TCRs表现出广泛的亲和力

获得这些珍贵的TCR后，研究人员进一步探究了它们的功能特性。他们将克隆出的TCR基因导入合适的细胞系中表达，然后检测这些工程化细胞在接触相应miHA抗原时的激活水平，以此作为衡量TCR亲和力或功能强度的指标。结果发现，无论是抗HA-1^H TCRs还是抗HA-2^V TCRs，都表现出了非常广泛的亲和力范围。这意味着，针对同一种miHA，自然免疫系统或治疗诱导产生的T细胞库实际上是由许多具有不同识别能力和激活阈值的TCR所组成的，而非均一的。

研究结论与意义

本研究成功地开发并验证了“TCXpress”这一新型高通量TCR克隆平台。该平台的核心优势在于其速度和简便性，它绕过了传统方法中耗时的核酸测序和基因合成步骤，实现了从单细胞到功能性TCR表征的快速转化。应用这一平台，研究人员分别从健康免疫个体和临床治疗患者体内，高效地克隆出了数量可观的、靶向两种重要白血病相关miHAs（HA-1^H和HA-2^V）的独特TCR。

更重要的是，功能分析揭示这些天然存在的或治疗诱导产生的抗miHA TCRs具有广泛的亲和力谱。这一发现具有深远的科学和临床意义：首先，它证实了针对特定miHA的T细胞免疫应答本身是高度多样化的，这为理解免疫应答的精细调控提供了新视角。其次，这种多样性意味着我们可以从中筛选出具有最佳功能特性（如高亲和力、高特异性）的TCR用于治疗。例如，选择亲和力适中的TCR可能有助于在保证疗效的同时进一步降低脱靶风险。此外，能够从患者疾病活动期和缓解期分离TCR，提示该平台可用于动态监测治疗相关的免疫应答，为研究免疫机制和生物标志物提供了工具。

总之，这项研究不仅提供了一种具有广泛应用前景的TCR发现新方法，极大地推动了个性化过继性T细胞治疗的进程，而且通过对抗miHA TCR库的深入分析，加深了我们对移植后抗白血病免疫应答本质的理解，为开发更安全、更有效的白血病免疫治疗策略奠定了坚实的基础。