基于纳米孔技术的合成肝素寡糖结构分析新策略——硫酸化模式与差向异构化的精准识别

《Carbohydrate Polymers》：Structurally defined synthetic heparin oligosaccharides reveal unique signatures for nanopore structural analysis of GAGs

本文报道了利用结构明确的合成肝素（HP）寡糖（DP4-12）作为参考标准，通过气溶素（AeL）纳米孔技术实现了对糖胺聚糖（GAGs）细微结构特征（如硫酸化模式差异、尿糖酸C5差向异构化）的高精度区分。该研究为建立GAGs纳米孔指纹图谱及测序奠定了关键基础，突破了传统质谱（MS）和核磁共振（NMR）技术在分析复杂糖链结构时的局限性。

　　

Highlight

先前研究已证明蛋白质纳米孔及其工程突变体在表征核酸和蛋白质等生物聚合物分子方面具有卓越的分析潜力。最近的研究已将范围扩展到碳水化合物，特别是利用气溶素（AeL）纳米孔。AeL已显示出分析糖类化合物，尤其是高度复杂的糖胺聚糖（GAGs）的能力。然而，据我们所知，本研究是首次报道对合成的、高度明确且均质的肝素（HP）和类肝素（HS）寡糖进行纳米孔分析，这些寡糖具有受控的硫酸化模式和差向异构化状态。本研究的关键发现是，AeL纳米孔能够区分具有相同分子式、仅由单个尿糖酸（UA）残基的差向异构体（即d-葡萄糖醛酸（d-GlcA）与l-艾杜糖醛酸（l-IdoA））或单个硫酸基团位置不同所区分的HP寡糖。这一发现代表了在开发GAGs测序方法方面迈出的重要一步。

Discussion（讨论）

糖胺聚糖（GAGs）是公认的极具挑战性的分析物。这在肝素（HP）和类肝素（HS）的情况下尤为突出，它们在自然界中以多分散且长的多糖链形式存在，在乙酰化、差向异构化和硫酸化模式上存在大量变异。此外，HP和HS链经受持续的重塑，导致形成不均匀但高度调控的复杂混合物（Kjellén & Lindahl, 2018; Pomin & Mulloy, 2018）。然而，尽管目前缺乏能够破译其复杂结构的高通量测序技术，但理解GAGs的结构-功能关系对于糖科学和生物医学研究至关重要。本研究通过使用化学合成的、结构明确的HP和其非硫酸化前体——类肝素（HN）寡糖，解决了这一挑战。这些寡糖被设计成包含特定的、受控的结构变异，使我们能够首次在GAGs系列中监测纳米孔信号如何响应序列中精细结构决定因素的变化。我们的结果表明，AeL纳米孔对硫酸基团的位置和尿糖酸（UA）残基的构型都非常敏感。这种高灵敏度使得能够区分传统方法（如质谱（MS））难以区分的结构异构体。值得注意的是，纳米孔分析在检测过程中保留了硫酸基团，这与质谱法中常发生的硫酸盐丢失形成对比（Chi et al., 2005; She et al., 2019），这是一个显著优势。获得的结果为建立HP特异性参考信号数据库铺平了道路，这对于未来使用机器学习算法解码更复杂、天然的GAGs混合物至关重要。然而，必须承认，将这种方法应用于天然存在的、高度异质的GAGs样本仍然面临挑战。未来的工作需要专注于提高检测通量、优化数据处理管道，并可能设计具有改进传感特性的纳米孔突变体。

Conclusions（结论）

本研究成功证明了使用结构明确的合成肝素（HP）寡糖来校准气溶素（AeL）纳米孔传感的可行性。我们获得了与特定硫酸化模式和差向异构化状态相关的可重复纳米孔电流特征。最重要的是，该方法能够区分仅在一个硫酸基团位置或一个尿糖酸（UA）差向异构体上不同的HP寡糖异构体。这些发现代表了在开发糖胺聚糖（GAGs）纳米孔测序技术方面的一个重大进步。建立的参考信号数据库为未来破译复杂GAGs混合物的结构信息提供了坚实的基础。尽管在将这种方法应用于天然GAGs样本之前仍需克服一些挑战，但本研究标志着我们在理解GAGs精细结构及其生物学功能方面迈出了关键一步。