综述：利用固态核磁共振揭示植物和真菌细胞壁结构特征及优先研究领域

《The Cell Surface》：Revealing structure and shaping priorities in plant and fungal cell wall architecture via solid-state NMR

本综述系统阐述了固态核磁共振（ssNMR）技术在解析植物和真菌细胞壁复杂结构中的独特优势。文章重点介绍了ssNMR如何在不破坏样品原生状态的前提下，揭示细胞壁生物大分子（如纤维素、几丁质、葡聚糖等）的结构多态性、动态特性及分子间相互作用，为理解细胞壁在应激适应、抗真菌药物耐药性以及生物质转化等过程中的功能机制提供了分子层面的见解，并对未来该技术在与细胞表面研究重点问题对齐方面的应用前景进行了展望。

　　

引言

植物和真菌细胞壁是关键的细胞外基质，不仅提供结构支持、介导与环境相互作用，还作为抵御应激的动态屏障。理解这些细胞壁在分子水平上的构建、重塑和功能机制，对于临床抗真菌治疗和生物技术应用（如生物燃料生产）都至关重要。然而，由于细胞壁具有异质性、复杂性以及动态重塑的特性，这一任务极具挑战性。固态核磁共振（ssNMR）光谱技术的出现，为解决这一难题提供了独一无二的强大工具，它能够在无需破坏其原生组织的情况下，揭示完整生物大分子的结构、动力学和相互作用。

ssNMR提供的关于生物聚合物结构、动力学和组装的生物物理见解

从ssNMR的视角看，天然细胞壁和人工生物材料遵循着保守的结构组装原则。这些系统通常由几个相互关联的组分构成：一个赋予机械强度并定义整体壁刚性的刚性支架；一个高度水合、允许水和小分子渗透分布的软基质；以及一个连接刚性和软性区域、促进结构整合和功能多样性的中间流动性区域。

在真菌中，刚性平台包括结晶的几丁质结构域；在植物中，则是纤维素微纤丝。基质碳水化合物常常装饰在这些刚性结构域的表面上。ssNMR提供了一套通用的极化方法，能够选择性检测刚性、流动和高度流动的组分，并进行定量测量。分子动力学可以通过测量NMR弛豫和偶极耦合来量化，这些参数可进一步转换为表征特定运动的序参数和相关时间。分子间相互作用通常使用二维和三维相关方法解析，其中可以检测到不同分子间的极化转移。水可及性则通过从局域水到生物分子的¹H极化转移来评估。

将ssNMR研究定位于植物和真菌细胞壁研究的新兴优先领域

近年来，高分辨率ssNMR研究显著增进了我们对真菌细胞壁结构和动力学的理解，特别是在抗真菌药物耐药性和环境应激适应的分子机制方面。ssNMR已成为剖析完整真菌细胞壁结构和动力学的关键工具，能够直接观察葡聚糖、几丁质和甘露蛋白等生物大分子，为理解细胞壁在环境和药理学应激下如何重塑提供分子水平的见解。

例如，ssNMR被用于表征烟曲霉、白色念珠菌和耳念珠菌在应对β-1,3-葡聚糖生物合成抑制剂（如棘白菌素）时细胞壁的重塑，以及评估尼克霉素对根霉属和毛霉属富含几丁质/壳聚糖的细胞壁的影响。这些研究揭示了ssNMR如何为靶向多糖合成的抗真菌策略和疫苗研发提供信息。同样，ssNMR也能揭示植物细胞壁聚合物的结构-功能关系，例如区分优先与纤维素表面结合的双重折叠木聚糖和优先与木质素纳米域结合的三重折叠木聚糖构象的功能多样性。

真菌细胞壁在抗真菌应激下适应性存活的动态重塑

真菌病原体表现出显著的细胞壁结构可塑性，使其能够适应环境应激，包括暴露于抗真菌药物。ssNMR的一个重要贡献在于能够以前所未有的分子细节揭示不同真菌物种如何响应抗真菌药物而重塑其细胞壁， uncovering物种特异性的策略，这些策略是药物耐受性和耐药性的基础。

对白色念珠菌和多重耐药的耳念珠菌的比较研究表明，尽管两者共享保守的细胞壁结构，但它们对棘白菌素的响应存在显著差异。两者在棘白菌素处理后都表现出细胞壁刚性化、水可及性降低，但耳念珠菌显示出更明显的内部刚性核心脱水，且其刚性核心在壁厚度、聚合物动力学或分子间堆积方面变化甚微。

在烟曲霉中，ssNMR揭示棘白菌素的疗效受到代偿性细胞壁重塑的限制。这一过程涉及分子的重组以及流动和刚性聚合物的动态重排。除了预期的β-1,3-葡聚糖合成抑制外，研究还揭示了一个复杂、多步骤的细胞壁结构重塑过程，包括几丁质初始增加导致的刚性化，随后壳聚糖和高度多态性的α-1,3-葡聚糖增加以恢复柔性，以及存活下来的β-葡聚糖被重组为高度支化的结构。

对少根根霉的ssNMR分析显示，其细胞壁刚性核心主要由高度多态性的几丁质和壳聚糖主导，β-葡聚糖极少。尼克霉素处理可选择性地移除一个特定的β-葡聚糖-几丁质-壳聚糖复合物，同时使细胞壁增厚和刚性化，这解释了现有几丁质抑制剂疗效有限的原因。

植物茎成熟过程中木质素-碳水化合物相互作用的演变

ssNMR通过提供直接、分子水平的见解，改变了我们对植物次生细胞壁结构和动力学的理解。最近对拟南芥花序茎的高分辨率¹³C标记ssNMR研究，揭示了不同发育阶段木质素-碳水化合物的相互作用。

数据显示，在茎的基部区域和较老的植物中，紫丁香基木质素逐渐富集，并与碳水化合物支架紧密交织。 notably，乙酰化木聚糖被确定为S-木质素的主要碳水化合物伙伴，而愈创木基木质素在早期木质化过程中则优先与甲基化果胶结合。这种单体特异性的结合凸显了植物成熟过程中木质素-多糖相互作用的选择性。

突变体分析进一步强调，木质素-碳水化合物接触的模式，而非木质素的总体含量，决定了细胞壁的力学性能。缺乏S-木质素的fah1突变体显示出减弱的木质素-碳水化合物界面。相反，ref3突变体尽管总木质素较少，但由于有利的S/G比率保持了强大的碳水化合物相互作用，从而维持了细胞壁的完整性。

将结构多态性与功能多样性及生物合成复杂性联系起来

结构多态性是生物分子在其天然细胞状态下的一个关键特征。在ssNMR谱图中，这种多态性表现为峰的多重性，每个分辨出的信号代表同一分子的独特结构形式。

例如，在植物细胞壁中分辨出双重和三重折叠的木聚糖以及纤维素中的七种不同葡聚糖链形式；在六种真菌中鉴定出总共45种几丁质形式。最近整合了¹H检测的技术进一步改善了对结构多态性的分辨能力。

一个关键问题是这些结构形式为何重要，以及它们是否能与结构功能和生物合成复杂性相关联。在根霉中，四种几丁质/壳聚糖同质形中只有一种与β-1,3-葡聚糖交联，并可被尼克霉素处理移除。在几丁质含量低的新型隐球菌中，五种α-1,3-葡聚糖形式在细胞壁组装中扮演着截然不同的角色。对于β-1,3-葡聚糖，其多态性的基础曾长期不明。最近结合¹H检测和动态核极化数据的研究提供了新见解，表明主要的a型信号与β-1,3-葡聚糖的三螺旋模型结构一致，而次要的b型则因与几丁质微纤丝表面相互作用而采用扁平的螺旋构象，这与植物中木聚糖在纤维素表面折叠的机制类似，暗示了跨物种生物聚合物组装原则的保守性。

结论与展望

ssNMR能够在不提取或化学修饰的情况下表征完整的细胞壁组装体和结构，保留生物大分子间的天然相互作用。这一能力揭示了以往无法获得的特征，使得ssNMR成为理解结构异质性如何贡献于机械功能、应激适应和生物质顽固性的核心工具。

尽管取得了这些进展，一些局限性仍制约着ssNMR的更广泛应用，包括需要与相关领域专家紧密合作以正确解释数据、分辨率限制、灵敏度挑战以及相对较低的通量。然而，随着灵敏度增强技术的持续进步、数据处理算法的改进以及人工智能的辅助，预计这些瓶颈将得到缓解，最终使该技术更能为细胞表面研究界所及。