连续世代Jurkat CD19-CAR的磷酸化蛋白质组学分析揭示TCRζ驱动的信号传导

《Cellular Signalling》：Phosphoproteomic analysis of successive Jurkat CD19-CAR generations reveals TCRζ-driven signalling

本研究针对CAR-T细胞疗法中因基底信号传导导致的长期留存率低及脱靶毒性等问题，研究人员通过基于LC-MS/MS的磷酸化酪氨酸（pY）蛋白质组学和CD69表达分析，结合小分子抑制剂，系统探究了共刺激域对CD19-CAR信号传导的影响。结果发现，无论共刺激域如何，TCRζ的纳入主导了pY信号谱，而Itk驱动了CD19-CAR Jurkat细胞的基底激活。该研究为在CAR-Jurkat筛选中评估新CAR设计提供了重要见解，并提示Itk是降低基底激活的潜在靶点。研究成果发表于《Cellular Signalling》。

　　

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法是个体化癌症治疗领域的一项革命性成就，为复发/难治性淋巴瘤患者提供了新的希望。然而，基底信号传导（即在缺乏同源抗原情况下的抗原非依赖性激活）导致的CAR-T细胞体内长期留存率低，以及脱靶毒性等问题，限制了该疗法的广泛应用。在CAR的研发过程中，研究人员常使用Jurkat T细胞（Jurkats）等模型系统，基于其激活能力（如CD69表达）和耐受重复抗原接触的能力来筛选胞内信号结构。尽管Jurkats是CAR筛选的标准模型，但不同代际CAR相对于关键T细胞受体（TCR）节点和CD69读值的Jurkat特异性磷酸化酪氨酸（pY）信号网络的映射尚不明确，这模糊了层级信号传导如何驱动激活的机制。为了解决这一问题，研究人员开展了本项研究，相关成果发表在《Cellular Signalling》上。

为了回答上述问题，研究人员主要运用了以下关键技术方法：基于稳定同位素氨基酸标记细胞培养（SILAC）的共培养磷酸化酪氨酸（pY）蛋白质组学工作流程，结合流式细胞术分析CD69表达，并利用针对关键TCR信号调节因子的小分子抑制剂进行选择性扰动。研究使用了模拟治疗性Yescarta的可变最小化第一、二、三代CAR构建体（ζ-CAR, 28ζ-CAR, BBζ-CAR, 28BBζ-CAR）在Jurkat细胞中进行表达。

3.1. CD19-CAR表达和质谱实验设计

研究人员构建了表达不同代际CD19-CAR的Jurkat细胞，所有CAR均高度表达。通过共培养实验和Western blot验证，发现28BBζ-CAR的基底Erk1^T202/^Y204/Erk2^T185/^Y187和PLCγ1^Y783磷酸化水平显著低于野生型Jurkat细胞。研究采用了SILAC共培养与pY富集质谱联用的工作流程，以精确解析每种CAR在共培养过程中启动的pY信号级联。

3.2. CD19-CARs中TCRζ的纳入主导了pY信号级联

通过磷酸化蛋白质组学分析，研究人员发现，与野生型Jurkat细胞相比，所有包含TCRζ的CD19-CARs在共培养后均能显著诱导大量pY位点的磷酸化，其模式与经典的pMHC/TCR连接诱导的信号相似。然而，CARs主要诱导TCRζ免疫酪氨酸激活基序（ITAMs）的磷酸化，而不像TCR激活那样涉及CD3ε、CD3γ和CD3δ的ITAMs。PTM-SEA分析显示，所有CD19-CARs均上调了Lck和Zap70等激酶的底物特征。这表明TCRζ的纳入是CD19-CAR Jurkat细胞中pY信号的主要决定因素，且TCRζ包含的CARs仅 engages 经典TCR信号的一个子集。

3.3. CD19-CARs中TCRζ的纳入增加了基底CD69表达，但不足以在抗原接触后激活

通过24小时共培养刺激实验评估CD69表达，研究人员发现，含有TCRζ的ζ-CAR即使在基底状态下也显示出比野生型Jurkat细胞更高的CD69+细胞百分比。然而，只有在包含共刺激域（CD28或4-1BB）的CARs中，共培养才能诱导CD69+细胞百分比和CD69+细胞平均荧光强度（MFI）的显著增加。这表明TCRζ足以提升基底CD69表达，但共刺激域对于抗原诱导的充分激活是必需的。

3.4. 全局PTP活性，而非PTPN22或SHP-1，阈值化CAR T细胞激活

为了探究蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）在CAR T细胞激活中的作用，研究人员使用了PTPN22抑制剂（PTPN22-IN-1）、SHP-1抑制剂（TPI-1）和广谱PTP抑制剂过钒酸盐（PV）。结果显示，抑制PTPN22或SHP-1对CAR Jurkat细胞的基底或共培养诱导的CD69表达没有显著影响。然而，PV处理能显著提高所有CARs在基底状态和共培养状态下的CD69+细胞百分比，特别是在BBζ-CAR中效果最为明显。这表明在Jurkat模型系统中，全局的PTP活性对于调节CD19-CAR激活至关重要，但TCR特异性的磷酸酶PTPN22和SHP-1并不参与阈值化CD19-CAR的激活。

3.5. Itk的抑制降低了基底CD69表达，同时维持了CD19-CAR T细胞在Jurkat模型系统中的激活能力

研究人员进一步使用Lck抑制剂（PP1）、Itk抑制剂（Soquelitinib）和MEK1/2抑制剂（U0126）探究激酶在CAR Jurkat激活中的作用。PP1和U0126处理显著削弱了共培养诱导的CD69表达增加。有趣的是，Soquelitinib处理显著降低了所有CD19-CAR Jurkat细胞在基底状态下的CD69+细胞百分比，使其降至未处理野生型Jurkat细胞的水平，但并未损害其共培养诱导的CD69表达增加能力。这表明Itk在驱动CD19-CAR Jurkat细胞的基底激活中起关键作用，但对于抗原诱导的激活是可有可无的。

本研究通过系统分析不同代际CD19-CAR在Jurkat模型中的信号传导，揭示了TCRζ在驱动pY信号中的核心作用，以及共刺激域在决定T细胞完全激活中的重要性。研究发现，全局PTP活性而非特定TCR相关磷酸酶是CAR激活的关键阈值设定者。尤为重要的是，研究指出Itk激酶是CD19-CAR Jurkat细胞基底激活的主要驱动因子，其抑制剂Soquelitinib能在不损害抗原应答能力的前提下降低基底激活水平。这些发现不仅深化了对CAR-Jurkat模型信号特性的理解，为基于该模型的高通量CAR筛选提供了重要的分子背景和解释框架，而且提示靶向Itk可能是降低CAR-T疗法中抗原非依赖性激活副作用的一种有前景的策略。尽管Jurkat细胞存在PTEN缺陷等局限性，但本研究清晰地描绘了该模型系统中CAR信号传导的层级关系，对CAR设计优化和功能评估具有指导意义。