NovaSeq6000平台的验证及自动化文库制备流程，以确保其符合临床体外诊断（CE-IVD）标准

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Validation of the NovaSeq6000 Platform and automated library preparation for CE-IVD equivalence

临床基因学验证中，采用Illumina NovaSeq6000 RUO平台与CE-IVD认证的Dx版本进行全外显子测序（WES）对比分析，验证自动化图书馆制备流程的等效性。通过96例临床样本的SNV和CNV检测，结果显示 RUO平台在SNV检测中100%与Dx版本一致，CNV检测敏感性随片段增大提升（150kb：79%；900kb以上：91.7%）。分析性能等效性及自动化流程优势为临床实验室合规应用提供依据。

　　近年来，随着基因测序技术的飞速发展，基因组学在临床诊断中的应用日益广泛。特别是下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术的引入，使得对遗传性疾病的检测变得更加高效和准确。然而，尽管NGS技术在科研和诊断领域具有巨大的潜力，其在临床环境中的应用仍然面临诸多挑战，尤其是在确保检测结果的可靠性、可重复性和符合监管标准方面。因此，对测序平台和分析流程的严格验证成为推动NGS在临床实践中的关键环节。

在这一背景下，本研究旨在验证Illumina NovaSeq6000平台（Research Use Only, RUO）在结合自动化文库制备系统Hamilton Microlab STAR后，是否能够达到CE-IVD认证的NovaSeq6000Dx平台的诊断性能。NovaSeq6000Dx作为一款获得欧洲体外诊断设备（In Vitro Diagnostic, IVD）认证的平台，通常被用作临床基因检测的黄金标准。然而，NovaSeq6000 RUO平台虽然在硬件性能上与NovaSeq6000Dx相当，但因缺乏IVD认证，无法直接用于临床诊断。因此，本研究通过比较两种平台在临床样本上的表现，为NovaSeq6000 RUO平台的临床应用提供了科学依据。

本研究采用96个临床样本进行全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES），这些样本涵盖了多种遗传性疾病，包括癌症、心肌病、神经发育障碍以及代谢性疾病等。通过使用NovaSeq6000 RUO平台与Hamilton Microlab STAR系统进行自动化文库制备，研究人员对比了其与NovaSeq6000Dx平台（手动文库制备）在检测单核苷酸变异（Single Nucleotide Variants, SNVs）和拷贝数变异（Copy Number Variants, CNVs）方面的表现。结果表明，NovaSeq6000 RUO平台在检测临床相关的SNVs方面表现出100%的完全一致性，无论是在阳性、阴性还是总体一致性指标上均达到预期标准。这说明该平台在识别与临床相关的SNVs方面具有高度的准确性与可靠性。

对于CNVs，研究结果显示，在检测大于150 kb的CNVs时，正向百分一致率（Positive Percent Agreement, PPA）为79%，而在检测大于900 kb的CNVs时，PPA则提升至91.7%。总体一致率（Overall Percent Agreement, OPA）在不同CNV大小阈值下均保持在较高水平。此外，覆盖率的均匀性和常染色体的可检测性在两种平台之间表现出高度一致性，这表明自动化文库制备并未对测序质量造成显著影响。

在本研究中，除了技术性能的评估，还关注了诊断效率。通过对96个样本的分析，研究人员发现，总的诊断率达到了32.4%。这一数值在不同临床指征下有所变化，例如在遗传性癌症病例中，诊断率高达35.1%，而在其他如神经发育障碍和心肌病等复杂疾病中，诊断率则略低，但依然在合理范围内。这些结果表明，NovaSeq6000 RUO平台在不同临床场景下的诊断性能具有良好的适应性。

尽管本研究在验证SNVs和CNVs方面取得了显著成果，但其也指出了几个局限性。首先，研究未包括对小的插入缺失（indels）和中等大小的CNVs的验证。这些变异类型的检测通常需要特定的生物信息学优化和额外的验证方法，如Sanger测序或阵列比较基因组杂交（array-CGH）。其次，研究未对不符合的CNV结果进行正交验证，而是依赖于CE-IVD认证的NovaSeq6000Dx平台作为参考标准。虽然这一方法确保了比较的权威性，但未来的研究可能需要进一步采用其他技术手段来增强对差异结果的验证能力。

此外，本研究的另一个局限性在于缺乏重复实验，这在正式评估可重复性和精确性方面至关重要。虽然本研究的主要目标是证明NovaSeq6000 RUO平台与CE-IVD认证的NovaSeq6000Dx平台在技术性能上的等效性，但未来的验证工作应考虑引入重复实验，以更全面地评估平台的稳定性。

总的来说，本研究的成果表明，结合自动化文库制备的NovaSeq6000平台在检测SNVs和大尺寸CNVs方面，能够达到与CE-IVD认证的NovaSeq6000Dx平台相当的诊断性能。这一发现为临床实验室采用自动化流程提供了有力支持，有助于提高检测效率、降低成本，并确保诊断结果的可靠性。随着NGS技术的不断进步，自动化流程的广泛应用将有助于推动基因组学在临床实践中的进一步发展。