综述：神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1）的小分子抑制剂

《Drug Discovery Today》：Small molecule inhibitors of the co-receptor neuropilin-1ni

本综述系统阐述了纳米抗体（Nbs）的起源、独特优势、工程化生成策略及其在科研、诊断和治疗领域的广泛应用。文章重点介绍了Nbs相较于传统单克隆抗体（mAbs）的小尺寸（~15 kDa）、高稳定性、易工程化等特性，如何赋能其在结构生物学（如稳定GPCR构象）、高灵敏度诊断（如PET成像）及创新疗法（如CAR-T细胞疗法、靶向药物递送）中解决关键难题，并概述了已获批的Nbs药物（如caplacizumab）及临床在研管线，展望了其广阔前景。

　　

重链唯一抗体：纳米抗体的来源

在1993年之前，重链唯一抗体（HcAbs）仅在人类和小鼠中罕见的重链沉积病的背景下被认知。然而，这一年，科学家在骆驼科动物中发现了天然存在的HcAbs。这类特殊的免疫球蛋白G（IgG）抗体仅由两条重链构成，缺少第一个恒定重链结构域（CH1）。在骆驼中，编码IgG2a的基因虽然包含CH1区域，但其5'剪接位点的单核苷酸替换（GT变为AT）消除了剪接信号，导致成熟mRNA中缺失CH1区域，从而产生HcAbs。这与人和小鼠重链病中整个CH1域大片段缺失的机制形成对比。骆驼HcAbs的可变区（VHH）通过框架区2（FR2）中的四个氨基酸替换，重塑了原本与轻链可变区（VL）结合的界面，使其更具亲水性，从而提高了VHH在水溶液中的溶解度，避免了病理性HcAbs常见的聚集倾向。VHH可以单独重组表达，形成所谓的“纳米抗体”（Nbs）。这一术语在2003年由Ablynx公司作为商标引入，但由于其恰当地反映了该抗体片段约15 kDa的小尺寸特点，现已泛指基因工程化的VHHs。随着Ablynx公司主要专利在2013年到期，Nbs在治疗、诊断和研究领域的兴趣激增。

纳米抗体及其独特优势

纳米抗体在许多场景下是传统单克隆抗体（mAbs）的等效替代品。尽管尺寸更小，但其内在的靶标结合亲和力和特异性与mAbs的VH-VL结构域相似，这可能是由于其互补决定区（CDRs）具有更长的环，提供了足够的抗原接触表面。然而，更重要的是，Nbs提供了某些超越mAbs的优势，从而催生了新的应用。

其小尺寸和亲水性表面使其具有出色的组织穿透能力，并能进入传统抗体难以触及的隐蔽或凹陷表位，例如酶活性口袋。Nbs还具有高稳定性，对温度、蛋白酶和不利pH条件具有更强的耐受性，使其更易于储存和处理。此外，由于其与人类VH3家族的高序列同源性，Nbs的免疫原性风险较低。

Nbs的模块化特性允许通过基因工程轻松构建多特异性或多价分子，例如双特异性Nbs或与血清白蛋白结合结构域（ABD）融合以延长半衰期。与构建双特异性mAb或单链可变片段（scFv）时常见的低表达产量和功能异常同源二聚体形成等问题相比，Nb构建体通常能减少这些挑战。

在药代动力学方面，Nbs的低分子量使其能够快速从血液中清除，这对于使用短半衰期放射性核素（如⁶⁸Ga, ¹⁸F）的成像应用非常有利，可以快速降低本底信号，获得高信噪比的图像。然而，这种快速的血清清除率对于治疗应用可能是一个限制，需要通过上述融合策略来克服。

工程化纳米抗体的生成：从动物免疫到理性计算设计

生成Nb库和筛选合适结合体的方法多种多样。传统方法是通过免疫骆驼科动物，利用体内的亲和力成熟过程产生高度多样性的库。作为一种低成本替代方案，携带羊驼Ig重链基因座的转基因小鼠（如“LamaMouse”）也被开发出来，用于产生聚焦的Nb库。

出于伦理和避免动物使用的考虑，以及针对非免疫原性靶标的需求，合成Nb库应运而生。这些库通常建立在稳定且非免疫原性的框架区骨架上，并基于天然VHH序列统计对CDRs进行随机或定向多样化。此类库的容量可达约10⁹个变体，并能产生与动物免疫相媲美的Nbs。例如，“Sybodies”是针对膜蛋白特定构象设计的合成Nbs，通过形状互补性增加获得构象特异性结合物的可能性。

近年来，机器学习（ML）等计算策略被应用于加速Nb的开发。例如，NanoAbLLaMA利用蛋白质大语言模型生成受种系序列约束的Nb序列。在筛选后优化方面，诸如AbNatiV等工具可以评估“天然性”并指导自动化人源化，以在保持抗原结合能力和稳定性的同时最小化免疫原性。深度学习方法如RFdiffusion甚至能够从头设计靶向预定表位的Nbs。这些计算工具为经典的Nb生成方法提供了强大的补充。

纳米抗体的应用

研究工具

在结构生物学中，Nbs作为“结晶伴侣”尤为有用。它们可以稳定动态蛋白质的特定构象，例如G蛋白偶联受体（GPCRs）的活性状态，这对于理解其激活机制至关重要。在冷冻电子显微镜（cryo-EM）中，Nbs可以被整合到“巨型抗体”（megabodies）或与“NabFabs”结合使用，以增加小蛋白目标的分子量或改善其在气-水界面的取向偏好，从而促进高分辨率结构解析。

在细胞生物学中，Nbs可作为细胞内探针。例如，与荧光蛋白融合的“显色体”（chromobodies）可以在活细胞中表达，用于标记和追踪内源性蛋白质。此外，光控Nbs（OptoNBs）或化学控制的Nbs允许以时空精确的方式可逆地调节细胞内靶蛋白的活性，为功能研究提供了强大工具。

诊断工具

在体外诊断方面，Nbs被用于开发高灵敏度的检测平台，如侧向流动分析（LFA）和生物传感器。它们的小尺寸和单体性质允许在传感器表面进行高密度、定向固定，从而提高抗原捕获效率。Nbs的稳定性还支持更苛刻的表面再生条件。

在体内成像方面，放射性标记的Nbs正迅速成为正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）的理想示踪剂。它们能快速从血液中清除并穿透组织，从而能够在注射后短时间内（如1-2小时）获得高对比度图像。针对HER2、程序性死亡配体1（PD-L1）等靶点的Nb示踪剂已进入临床研究阶段，用于癌症患者的分层和治疗反应监测。一个挑战是Nbs在肾脏的积聚较高，这可能影响对肾脏附近组织的分析，但通过优化放射性标记化学可以缓解这一问题。Nbs也适用于其他成像模式，如近红外荧光成像和超声/光声成像。

治疗工具

癌症治疗

Nbs在癌症治疗中显示出巨大潜力。其改善的肿瘤穿透性和均匀分布特性有助于克服大分子抗体药物在缺氧肿瘤区域递送不足的问题。通过融合ABD等策略延长循环时间，可以进一步提高治疗效果。

Nbs的模块化特性使其易于整合到各种治疗平台中。例如，它们可以作为靶向单元用于抗体药物偶联物（ADCs），即Nb-药物偶联物（NDCs），利用其快速肿瘤渗透和清除来减少脱靶毒性。在细胞治疗领域，Nbs作为嵌合抗原受体（CAR）的靶向结构域，相比scFv具有更简单的设计和更低的错误配对倾向。FDA已批准一款基于Nb的CAR-T细胞疗法（ciltacabtagene autoleucel）用于治疗多发性骨髓瘤。

此外，Nbs可用于实现免疫检查点抑制剂（如抗PD-L1, 抗CTLA-4 Nbs）的局部递送，例如通过基因工程改造的定植益生菌在肿瘤部位原位生产，以限制全身暴露和毒性。针对脑部肿瘤或转移灶，Nbs因其较小的尺寸而具有更好的血脑屏障（BBB）穿透潜力，或可作为“分子穿梭机”帮助治疗性大分子穿越BBB。

感染性疾病治疗

在抗感染领域，Nbs可针对细菌和病毒。对于细菌，策略包括中和毒素（如肉毒杆菌神经毒素）、抑制毒力因子（如针对沙门氏菌鞭毛蛋白FliC或铜绿假单胞菌III型分泌系统蛋白PcrV）或抑制耐药机制（如β-内酰胺酶）。对于病毒，Nbs可通过阻断病毒进入（如针对SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域RBD的Nbs）或干扰病毒复制来发挥作用。针对HPV、拉沙病毒等的Nbs也在开发中。一种有前景的方法是使用工程化细菌（如PROT3EcT系统）在感染部位原位分泌治疗性Nbs。

其他疾病治疗

Nbs在炎症性疾病（如通过乳酸菌口服递送抗TNFα Nbs治疗炎症性肠病）、自身免疫性疾病（如靶向补体C5的gefurulimab治疗重症肌无力，靶向IL-17A/F的sonelokimab治疗银屑病关节炎）和神经系统疾病（如针对阿尔茨海默病（AD）中淀粉样蛋白-β或tau蛋白的Nbs）中也展现出治疗潜力。甚至有研究报道了一种作为μ-阿片受体（μOR）拮抗剂的Nb，为开发新型镇痛药或减轻阿片类药物副作用提供了蓝图。

毒液中毒治疗

Nbs作为新一代抗蛇毒血清显示出潜力。它们可以中和蝎子、蛇等毒液中的毒素，其高稳定性、低成本生产和优异的组织分布特性使其有望克服传统血清疗法的局限性。

已获批的纳米抗体药物

截至目前，已有数款Nb药物获得监管机构批准。2019年，caplacizumab（靶向血管性血友病因子vWF）获FDA批准用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）。2021年，envafolimab（抗PD-L1 Nb）在中国获批用于治疗特定晚期结直肠癌。2022年，ozoralizumab（抗TNFα Nb）在日本获批用于治疗类风湿关节炎。同年，ciltacabtagene autoleucel（靶向BCMA的Nb-CAR-T细胞产品）获FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤。此外，还有多个Nb药物处于临床开发后期。

结论

纳米抗体凭借其独特的理化性质和高度可塑性，已成为生命科学和医学研究中不可或缺的工具。从基础研究到临床转化，Nbs正在多个领域解决传统方法面临的挑战。随着工程化技术的不断进步和更多临床数据的积累，预计未来将有更多基于Nb的创新疗法和诊断工具问世，为人类健康带来新的希望。