新型双芳基TTR稳定剂：治疗心脏淀粉样变性的有前景策略

《European Journal of Medicinal Chemistry Reports》：New promising transthyretin stabilizers for cardiac amyloidosis treatment

本刊推荐：为解决TTR淀粉样变性(ATTRs)治疗中现有稳定剂(如tafamidis)响应率不足和成本高昂的问题，研究人员设计合成了一系列新型双芳基衍生物(1a-l, 2a-l, 3a-l)作为TTR纤维形成抑制剂。研究发现化合物1a、1d、2l和3g能有效抑制野生型和突变型(V30M, V122I)TTR聚集，通过荧光位移分析、等温滴定量热法(ITC)和X射线晶体学证实其高亲和力结合T4结合位点(T4-BPs)，且细胞实验显示无内皮细胞和心肌细胞毒性。该研究为开发新型TTR稳定剂提供了重要先导化合物。

　　

在医学研究领域，蛋白质错误折叠引发的疾病一直是科学家们攻坚的难点。转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性(ATTRs)就是其中一类令人困扰的疾病，它会导致异常蛋白质在心脏、神经等组织中沉积，引发器官功能衰竭。特别是心脏淀粉样变性，已成为老年人心力衰竭的重要原因之一。

目前，临床上使用TTR稳定剂tafamidis是治疗ATTRs的主要手段，但问题在于部分患者对现有药物不响应，且治疗费用昂贵。这就像是一把钥匙不能打开所有的锁，科学家们迫切需要寻找更多样化的"钥匙"来应对这一挑战。正是在这样的背景下，意大利比萨大学药学院的研究团队开展了一项创新性研究，旨在开发新型TTR稳定剂，相关成果发表在《European Journal of Medicinal Chemistry Reports》上。

研究人员主要运用了合理的药物设计策略，基于前期发现的先导化合物骨架，设计合成了三个系列共36个新型双芳基衍生物。在技术方法上，团队采用了系统的体外评价体系：通过浊度法和硫黄素T(ThT)荧光法筛选化合物的抗聚集活性；利用ANS荧光位移实验和等温滴定量热法(ITC)测定化合物与TTR的结合亲和力；借助X射线晶体学解析复合物三维结构；并通过MTT法进行细胞毒性评价。这些方法的综合运用为全面评估化合物活性提供了可靠保障。

2.1. 双芳基衍生物(1a-l, 2a-l, 3a-l)的设计与合成

研究人员基于前期研究的单芳基骨架(Type A)，设计了一类新型双芳基衍生物(Type B)。这些化合物特征是在两个芳环(X和Y)之间通过氧肟键连接，其中Y环的羧基分别位于邻位、间位和对位。合成路线通过N-羟基邻苯二甲酰亚胺与取代苄溴反应，经氨解、成盐酸盐后，再与相应的羧基苯甲醛缩合，得到最终产物。核磁共振氢谱(¹H-NMR)显示所有化合物均以E构型异构体存在。

2.2. 合成化合物的抗聚集特性研究

2.2.1. TTR酸介导的聚集筛选

通过浊度法检测所有化合物对野生型TTR(wt-TTR)聚集的抑制效果。结果显示，15个衍生物的纤维形成百分比(%FF)低于阳性对照tolcapone(tolc)，其中1a、1d、2a、3j的表现与diflunisal(dif)相当。重要的是，在X环邻位取代的化合物，特别是带有-CF₃(1a)、-Cl(1d)、-OCH₃(1g)和2-Cl,6-F(1l)的衍生物，显示出更好的抑制活性。而Y环上羧基的位置对活性影响不大，表明X环的取代基类型和位置是影响活性的关键因素。

2.2.2. TTR硫黄素T结合实验

ThT荧光实验进一步验证了浊度法的结果。该实验特异性检测富含β-折叠的淀粉样纤维，与浊度法可形成互补。结果显示，邻位取代的化合物，特别是含有-CF₃和-Cl的衍生物，在抑制纤维形成方面表现优异。根据两个实验的综合结果，研究人员筛选出四个最具潜力的化合物：1a、1d、2l和3g进行后续深入研究。

2.2.3. TTR突变体的酸介导聚集实验

对选定的四个化合物在两种常见TTR突变体(V30M和V122I)上进行测试，结果显示所有化合物对突变体均表现出良好的抑制效果，其%FF值与dif相当，优于tolc，表明这些化合物对不同基因型的TTR都具有稳定作用。

2.3. 化合物1a、1d和2l与TTR T₄结合位点的结合

2.3.1. ANS位移结合实验

通过竞争性结合实验测定化合物置换荧光探针ANS的能力，结果显示1a、1d和2l对wt-TTR、V30M-TTR和V122I-TTR的IC₅₀值在1.70-3.00 μM范围内，与tolc相当，而对V122I突变体的活性甚至更优。这一结果证实卤素取代的化合物与卤素结合口袋(HBPs)具有更强的相互作用。

2.3.2. 等温滴定量热法(ITC)

ITC实验定量研究了化合物与TTR的结合热力学参数。结果显示，1a和1d的解离常数(K_d)在400-850 nM范围内，虽然低于tolc(100 nM)，但显著优于dif(1240-1910 nM)。结合过程为放热反应，表明结合主要由焓驱动。值得注意的是，1a和1d对wt-TTR和V30M-TTR的亲和力相当，对V122I-TTR略有下降，这一趋势与ANS实验结果一致。

2.3.3. 1a、1d和3g与TTR复合物的晶体结构

X射线晶体学分析揭示了化合物与TTR的确切结合模式。三个化合物均以"正向结合"模式占据T₄结合位点(T₄-BPs)，羧基朝向通道入口的Lys15/15'，第二个芳环深入疏水空腔。具体而言，1a的三氟甲基指向Thr119/119'侧的HBP3/3'；1d的氯原子也定位于HBP3/3'；3g的甲氧基则采取相似取向。羧基与Lys15/15'之间形成直接或水分子介导的氢键网络，这些相互作用对稳定结合至关重要。

2.3.4. 体外毒性研究

细胞毒性实验表明，在生理相关浓度下(最高10 μM)，所选化合物对内皮细胞和心肌细胞的代谢活性均无显著影响，而tolc在浓度高于7 μM时对内皮细胞显示出毒性。这一结果证明了这些化合物具有良好的生物相容性。

本研究成功设计合成了一系列新型双芳基TTR稳定剂，并通过多层次的体外评价证实了其高效性和安全性。特别值得关注的是化合物1a和1d，它们对野生型和突变型TTR均表现出优异的稳定效果，其结合模式通过晶体结构得到了明确阐释。这些化合物不仅为理解TTR稳定剂的作用机制提供了结构基础，更重要的是为开发新一代ATTRs治疗药物奠定了坚实基础。在当前tafamidis存在局限性的背景下，该研究具有重要的临床转化价值，有望为ATTRs患者提供更多治疗选择。未来研究可进一步优化化合物药代动力学性质，推动其向临床应用迈进。