综述：光循环动物视蛋白的发现与设计——从非视觉视蛋白研究到基因治疗的潜在应用

《Eye and Vision》：Discovery and design of photocyclic animal opsins: potential application to gene therapy from non-visual opsin research

本综述系统梳理了动物视蛋白的分子多样性，重点介绍了新发现的光循环动物视蛋白（Opn5L1）及其独特的光致循环反应机制（涉及Cys188残基与视黄醛形成加合物）。文章探讨了从天然视蛋白（如单稳态的脊椎动物视紫红质和双稳态的Opn4、Opn5）设计“人工光循环视蛋白”（如G188C突变体）的策略，并展望了其在光遗传学基因治疗（例如利用人视紫红质基础改造以规避免疫排斥、治疗视网膜病变如视网膜色素变性）中的巨大潜力，为开发新型疗法提供了创新视角。

　　

视觉与非视觉视蛋白的分子多样性

动物界普遍存在着一类光感受蛋白——视蛋白。其中，视紫红质（Rhodopsin）是研究最为深入的一种，它在人和小鼠视网膜的视杆细胞中作为视觉传感器发挥作用。视紫红质在光感受后产生激活态，触发信号转导级联反应，最终引起细胞的超极化响应。这种激活态是一种亚稳态中间体，无法通过光反应或热反应回到暗态。因此，脊椎动物视紫红质被归类为单稳态视蛋白。

近年来，动物基因组信息的积累极大地扩展了已知的视蛋白基因库，这些基因负责视觉和非视觉光感受功能。对这些视蛋白的分析表明，许多视蛋白，包括非视觉视蛋白如黑视蛋白（Opn4）和神经psin（Opn5），在光感受后能形成稳定的激活态，并且该激活态可以通过光反应回到暗态。这些视蛋白具有暗态与激活态之间的光可逆性，因此被归类为双稳态视蛋白。

此外，研究者此前从非哺乳类脊椎动物中鉴定出一种不同类型的非视觉视蛋白——Opn5L1，其活性由一种光循环反应控制。这种光循环反应与通道视紫红质（Channelrhodopsin）的反应非常相似，并通过一种涉及第188位半胱氨酸残基的特殊机制实现，该机制迄今为止在其他任何视蛋白中均未观察到。

视觉细胞的形态学特征

包括人类在内的许多脊椎动物的视网膜中都有视觉细胞，这些是专门用于视觉光感受的神经元。脊椎动物的视觉细胞在形态上可分为两类：视杆细胞和视锥细胞。它们在不同的光照条件下发挥作用，视杆细胞主要负责暗视觉，视锥细胞主要负责明视觉。这些视觉细胞具有独特的形态，其外段包含高度有序的叠层膜结构。视杆细胞具有与质膜分离的叠层盘膜，而视锥细胞则具有与质膜相连的叠层膜内褶结构。这些叠层膜结构有助于大量膜蛋白视蛋白的排列。光感受蛋白视蛋白在叠层膜中的密集排列提高了捕获光子的效率。脊椎动物视觉细胞外段的这种膜结构在形态发生上源于从细胞表面延伸的纤毛。因此，脊椎动物视觉细胞被称为纤毛型光感受器细胞。

类似地，软体动物和节肢动物的视网膜中也存在用于视觉光感受的视觉细胞。这些视觉细胞同样具有包含大量视蛋白分子的叠层膜结构，以提高光子捕获效率。然而，软体动物和节肢动物视觉细胞的膜结构在形态发生上不同于脊椎动物视觉细胞。其外段的膜结构是由细胞膜产生的、长而细的微绒毛组成的感杆束阵列。因此，软体动物和节肢动物的视觉细胞被称为感杆型光感受器细胞。

脊椎动物视紫红质与软体动物、节肢动物视紫红质的分子特性

脊椎动物视紫红质是研究历史最悠久的视蛋白，其分析历史可追溯至约150年前。视紫红质具有七个跨膜螺旋结构域，这是G蛋白偶联受体（GPCR）的典型结构元件。作为光感受蛋白，视紫红质通过希夫碱键与11-顺式视黄醛结合，该键连接至第七螺旋中的一个赖氨酸残基。光诱导视黄醛从11-顺式构型异构化为全反式构型，从而导致视紫红质激活态的形成。视紫红质的激活态与异源三聚体G蛋白转导素（Gt）相互作用，Gt特异性地表达于脊椎动物视觉细胞中，并促进Gtα亚基上的GDP-GTP交换反应。Gt的α亚基随后与βγ亚基复合物解离，并刺激磷酸二酯酶（PDE）水解环磷酸鸟苷（cGMP）。接着，质膜中的环核苷酸门控通道（在黑暗条件下开放）由于光照下cGMP浓度降低而关闭。通道的关闭最终引发细胞反应。因此，脊椎动物“纤毛型”视觉细胞的电反应是通过视紫红质光活化触发的细胞内环核苷酸信号传导发生的。

脊椎动物视紫红质的详细分子特性已通过生物化学和生物物理学方法进行分析。在脊椎动物视杆细胞中，视紫红质分子同时光转化为激活态。这种激活态是热不稳定的，会自发释放全反式视黄醛，形成脱辅基蛋白。该脱辅基蛋白从主要在视网膜色素上皮中进行的视觉循环中摄取11-顺式视黄醛，并再生原始的暗态。因此，从激活态形成暗态（非活性态）必须依赖于11-顺式视黄醛的供应系统，热反应或第二个光子吸收都不能直接导致从激活态到暗态的转化。此外，脱辅基蛋白直接掺入全反式视黄醛也无法形成激活态。因此，脊椎动物视紫红质专用于光感受，并被归类为单稳态视蛋白，因为只有暗态是热稳定的。

软体动物和节肢动物的视紫红质也具有共同的结构元件，包括七个跨膜结构域和发色团11-顺式视黄醛。光感受后，软体动物和节肢动物视紫红质通过视黄醛异构化为全反式构型形成激活态。视紫红质的这种激活态激活Gq型G蛋白，进而刺激磷脂酶Cβ（PLCβ）。PLCβ然后催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）转化为肌醇-1,4,5-三磷酸（IP₃）和二酰基甘油（DAG）。最终，质膜中Ca²⁺通道（在黑腹果蝇中称为瞬时受体电位（TRP）和TRP样（TRPL）通道）的光依赖性开放引发视觉细胞的去极化，尽管连接PLCβ激活和Ca²⁺通道开放的详细分子组分仍存在争议。因此，软体动物和节肢动物“感杆型”视觉细胞的电反应被认为是通过视紫红质光活化触发的细胞内IP₃/Ca²⁺信号传导发生的。

对软体动物和节肢动物视紫红质分子特性的分析清楚地揭示了它们与脊椎动物视紫红质分子特性的几个不同之处。捕获光子后，软体动物和节肢动物视紫红质形成热稳定的激活态（全反式视黄醛结合态），不会立即释放全反式视黄醛。在视觉细胞的电反应去极化之后，激活态的视紫红质可以通过吸收第二个光子直接光转化为暗态（11-顺式视黄醛结合态）。这意味着光可以有效地促进软体动物和节肢动物视紫红质内部视黄醛从全反式构型向11-顺式构型的异构化，而这在脊椎动物视紫红质中是无法观察到的。因此，软体动物和节肢动物视紫红质具有两个稳定状态，即暗态（非活性态）和激活态，它们可以通过光感受相互转化。此外，软体动物和节肢动物视紫红质的脱辅基蛋白可以在没有光信号的情况下直接掺入全反式视黄醛形成激活态。这是许多GPCRs中常见的现象，它们可以通过直接结合称为激动剂的扩散性配体而被激活，但在脊椎动物视紫红质中未见。基于这些分子特性，软体动物和节肢动物视紫红质被归类为具有热稳定暗态和激活态的双稳态视蛋白。

负责“非视觉”光感受的视蛋白的分子多样性

动物也利用环境中的光作为除视觉之外各种生理功能的信息源。人类会无意识地根据光线调整瞳孔大小，这有助于适应不同的光照条件，被称为瞳孔光反射。许多动物，包括人类，根据光环境的变化感知时间。这是通过光信号对其内部生物钟的夹带实现的。除了基于昼夜节律的行为变化外，一些动物会根据季节变化改变行为，例如在特定季节的繁殖行为。这些行为是由感知日长变化触发的，称为光周期现象。此外，一些动物会改变体色以匹配周围的光环境，这被称为背景适应，有助于动物融入周围环境以避免被捕食者发现。这些光依赖性生理功能被称为“非视觉”光感受功能，其中大多数被认为是由视蛋白的光感受触发的。

动物基因组分析的进展提高了我们对非视觉光感受功能背后分子实体的理解。人类有四个视觉视蛋白基因：视紫红质和三种视锥色素。这三种视锥色素各自具有特征性的光谱敏感性，即红、绿、蓝敏感，这与唯一的视杆色素——绿敏感的视紫红质形成对比。这种视觉视蛋白的组成使得在明亮光照条件下产生色觉，在昏暗光照条件下产生单色视觉。此外，研究表明人类基因组还包含另外五个视蛋白基因：OPN3、OPN4（黑视蛋白）、OPN5（神经psin）、RGR（视网膜G蛋白偶联受体）和RRH（视黄醛色素上皮细胞来源的视黄醛脱氢酶），它们被认为有助于非视觉光感受。

在这些非视觉视蛋白中，视网膜G蛋白偶联受体（RGR）是首个被鉴定的视蛋白。RGR蛋白主要分布于视网膜色素上皮中。该蛋白在黑暗中特异性结合全反式视黄醛，而非11-顺式视黄醛，并在光感受后通过视黄醛的异构化产生11-顺式视黄醛。然而，该蛋白被认为缺乏激活G蛋白的能力。对RGR缺陷小鼠的分析表明，RGR的生理作用是作为视黄醛光异构酶，为视觉视蛋白供应11-顺式视黄醛。因此，尽管RGR属于GPCR家族，但它具有除G蛋白激活之外的重要分子功能。

Opn4（黑视蛋白）是迄今为止表征的脊椎动物和无脊椎动物非视觉视蛋白中研究最深入的一个。Opn4最初从非洲爪蟾（Xenopus laevis）的真皮黑色素细胞中分离出来，尽管在该动物的眼睛和脑中也发现了它的表达。其在真皮黑色素细胞中的表达提示Opn4可能控制与体色变化相关的皮肤色素沉着。因此，这种视蛋白被命名为黑视蛋白。此后，其哺乳动物直系同源物的发现及其在哺乳动物视网膜一部分神经节细胞（称为本质光敏视网膜神经节细胞，ipRGCs）中的表达，促进了对Opn4蛋白分子特性及生理相关性的理解。Opn4蛋白结合11-顺式视黄醛，在黑暗中形成蓝敏感色素。光感受后，视黄醛异构化为全反式构型诱导Opn4蛋白激活态的形成。这种激活态是热稳定的，并且可以通过光转化不仅回到暗态（11-顺式视黄醛结合态），还可以转化为7-顺式视黄醛结合态。这种7-顺式视黄醛结合态是另一种具有蓝移光谱敏感性的非活性态，并通过光感受转化为激活态。这一观察结果表明，哺乳动物Opn4在两个非活性态和一个激活态之间表现出独特的光平衡，这可以在时间上和色谱上拓宽Opn4表达的ipRGCs中光依赖性活动的调谐范围。因此，哺乳动物Opn4是一种“三稳态”视蛋白，是类似于软体动物和节肢动物视紫红质的一种双稳态视蛋白。

此外，在ipRGCs中，Opn4蛋白激活Gq介导的信号转导级联，引发细胞电反应，这也类似于软体动物和节肢动物视网膜中感杆型视觉细胞的信号传导。对Opn4敲除小鼠的分析揭示了Opn4调控的几种非视觉功能。最重要的发现是Opn4依赖的昼夜节律夹带。尽管缺乏视杆和视锥细胞的小鼠仍表现出光依赖的昼夜节律振荡相位调节，但额外的Opn4敲除导致完全丧失光夹带能力。然而，具有功能性视杆和视锥细胞的Opn4敲除小鼠保持了昼夜节律的光夹带。这些结果表明，ipRGCs中的Opn4在昼夜节律振荡的光夹带中与视紫红质和视锥色素存在功能冗余。此外，瞳孔光反射也受Opn4调控，这与视紫红质和视锥色素的贡献是冗余的。现在很清楚，通过ipRGCs中的Opn4进行的光感受可以调节眼睛和大脑中其他重要的非视觉功能。

从非视觉视蛋白研究中发现光循环动物视蛋白

在人类视蛋白基因中，Opn5（神经psin）是最近被鉴定的。2003年关于Opn5（当时称为神经psin）的第一份报告揭示了Opn5 mRNA在视网膜和脑中的表达。然而，在此后的一段时间里，关于Opn5蛋白的分子特性、详细表达模式和生理功能几乎没有报道。在此背景下，我们在2010年代初期报告了Opn5蛋白的详细分子特性。Opn5蛋白直接结合11-顺式视黄醛，形成短波长敏感色素，其光谱敏感性覆盖从紫外（UV）区域到蓝色区域。这种光谱敏感性在从鱼类到人类的广泛脊椎动物物种的Opn5蛋白中是保守的。这意味着Opn5蛋白为脊椎动物（包括人类）吸收最短波长光提供了分子基础之一。光感受后，Opn5蛋白通过视黄醛异构化为全反式构型形成激活态。这种激活态是热稳定的，并且可以通过随后的光感受转化回原始的暗态。因此，Opn5被归类为双稳态视蛋白。

我们还分析了小鼠和普通狨猴（一种新大陆猴）视网膜和脑中Opn5 mRNA或蛋白的详细表达模式。我们在视网膜的一部分神经节细胞和下丘脑的视前区检测到Opn5表达信号，这在小鼠和普通狨猴之间是保守的。对哺乳动物Opn5重组蛋白和表达哺乳动物Opn5的培养细胞的分析表明，哺乳动物Opn5蛋白可以激活Gi型或Gq型G蛋白。然而，尚无研究显示小鼠视网膜或脑中Opn5阳性细胞存在光依赖性电生理反应，这可能是因为这些细胞中Opn5蛋白表达水平较低，以及缺乏合适的用于可视化Opn5阳性细胞的小鼠品系。

自2010年代末以来，基于对Opn5敲除小鼠的分析，Opn5的生理功能被陆续报道。Opn5缺陷小鼠在暗适应和明适应条件下保持正常的视网膜电图。然而，Opn5敲除导致视网膜、角膜和皮肤中的局部昼夜节律振荡器与光/暗周期同步化丧失，并且在短波长条件下损害行为的昼夜节律光夹带。因此，Opn5依赖的视网膜昼夜节律振荡器重置可能影响行为节律。如前所述，Opn5蛋白具有相对较宽的吸收光谱，可以覆盖从紫外区域到蓝色区域的扩展波长范围。这种光谱特性不适合视觉颜色辨别，但可能有利于重置昼夜节律。此外，Opn5介导视网膜和玻璃体中光依赖的血管发育。因此，通过Opn5的短波长光感受作为一个重要的发育时序线索，调节视轴清晰度以实现正常的视觉功能。Opn5还调节眼中的脉络膜厚度，这在调整眼球大小中起关键作用。这意味着每天暴露于短波长光一定时间可以防止眼球伸长，从而抑制近视。

除了越来越多证据表明Opn5在视网膜中的重要作用外，通过研究敲除小鼠，也揭示了Opn5在大脑中的生理相关性。视前区的一部分Opn5阳性细胞投射到棕色脂肪组织以调节产热。尽管关于哺乳动物是否能够检测大脑中的光信号以执行某些生理功能存在争议，但这是第一篇阐明视蛋白介导的哺乳动物大脑光感应途径的论文。短波长敏感的Opn5蛋白的功能重要性也在非哺乳类脊椎动物中有所报道。在鸟类中，Opn5分布于视网膜的一部分无长突细胞和神经节细胞、松果体和下丘脑的脑室旁器官中。松果体中的Opn5表达细胞显示血清素阳性信号，表明这些细胞参与褪黑激素分泌。脑室旁器官中的Opn5表达细胞也与血清素阳性信号重叠，表明这些细胞作为光周期传感器，在长日照条件下诱导睾丸生长。在青鳉鱼中，Opn5阳性细胞独特地存在于脑垂体中，并在短波长条件下释放促黑激素，诱导身体出现黑色素沉着。这种机制可能有助于保护免受紫外线伤害。

对脊椎动物基因组中Opn5基因的搜索表明，包括人类和小鼠在内的哺乳动物只有一个Opn5基因，而非哺乳类脊椎动物则有额外的Opn5基因，例如Opn5L1和Opn5L2，它们与哺乳动物Opn5是旁系同源物。我们对这些在非哺乳类脊椎动物中发现的Opn5基因的分析表明，Opn5L1是一种独特的光循环视蛋白，其分子特性与单稳态视蛋白（如脊椎动物视紫红质）和双稳态视蛋白（如无脊椎动物视紫红质和哺乳动物Opn5）截然不同。

在鸡视网膜中，Opn5L1表达于内核层的内侧，可能是一个亚群的无长突细胞。Opn5L1也分布于鸡大脑的多个区域，包括端脑的中皮层和间脑的室旁核。因此，Opn5L1被认为在非哺乳类脊椎动物的视网膜和大脑中作为非视觉视蛋白发挥作用。脊椎动物Opn5蛋白氨基酸序列的比较显示，Opn5L1蛋白在第三螺旋胞质侧的Asp-Arg-Tyr（DRY）三联体基序处具有特征性突变，该基序在包括人和小鼠Opn5蛋白在内的视紫红质样GPCRs中高度保守，并调节GPCR构象变化。然而，例如，鸡Opn5L1蛋白包含Val-Cys-Cys（VCC）取代了DRY基序。这提示Opn5L1蛋白可能缺乏G蛋白激活能力。在此背景下，我们分析了Opn5L1蛋白的详细分子特性，即对视黄醛异构体的结合偏好、光活化过程和G蛋白激活。

关于对视黄醛异构体的结合选择性，Opn5L1蛋白即使在孵育11-顺式视黄醛后仍结合全反式视黄醛。这意味着Opn5L1蛋白特异性结合全反式视黄醛，并且丧失了直接掺入11-顺式视黄醛的能力。我们的光谱分析显示，鸡Opn5L1蛋白掺入全反式视黄醛形成绿敏感色素，其光谱峰值位于510 nm。我们还观察到，全反式视黄醛直接与Opn5L1的脱辅基蛋白结合，尽管第三螺旋胞质侧保守的DRY三联体基序发生突变，但仍导致G蛋白激活能力显著增加。因此，全反式视黄醛可以作为激动剂，在没有光信号的情况下形成Opn5L1蛋白的激活态。然而，需要注意的是，将其他全反式类视黄醇（如视黄醇和视黄酸）添加到Opn5L1蛋白不能诱导G蛋白激活。

我们还分析了鸡Opn5L1蛋白G蛋白激活能力和吸收光谱的光依赖性变化。Opn5L1蛋白在黑暗中的G蛋白激活能力被黄光照射抑制，这表明Opn5L1蛋白可以被光信号失活。同时，光照射导致可见光和近紫外区域吸光度完全消失，并在270 nm处出现小幅吸光度增加。“270 nm产物”的形成在其他视蛋白中未观察到，被认为源于视黄醛光异构化之外的未知机制。我们的详细分析揭示，光信号诱导视黄醛从全反式构型异构化为11-顺式构型，产生光谱峰值位于500 nm的中间态，随后通过未知的热反应形成“270 nm产物”。需要指出的是，“270 nm产物”的形成并非通过希夫碱键水解后释放11-顺式视黄醛而发生。此外，我们观察到Opn5L1蛋白G蛋白激活能力和吸收光谱的后续变化。我们检测到在黑暗孵育期间G蛋白激活能力的恢复。这种活性的增加伴随着510 nm处吸光度的恢复。这些观察结果表明，光失活的Opn5L1蛋白可以通过希夫碱键未水解的视黄醛热异构化，经历热恢复至原始的暗态（全反式视黄醛结合态）。

为了深入了解Opn5L1蛋白的这种特性分子特性，我们寻找负责这种未知热反应的氨基酸残基。我们成功鉴定了一个关键的第188位半胱氨酸残基，该残基在非哺乳类脊椎动物的Opn5L1蛋白中高度保守，而在其他Opn5蛋白中不存在。光感受后，Opn5L1蛋白的C188T突变体形成中间态，即“500 nm产物”，但随后不能转化为“270 nm产物”。这表明“270 nm产物”的独特形成依赖于涉及Cys188的某种分子机制。然后我们假设，在Opn5L1蛋白光感受后，视黄醛共轭双键系统通过视黄醛和半胱氨酸残基之间形成共价加合物而被破坏。液相色谱-质谱分析证实，由Opn5L1蛋白蛋白酶解产生的包含Cys188的短肽片段在“270 nm产物”中与视黄醛结合。这一结果支持了在“270 nm产物”中Cys188和视黄醛之间形成加合物的假设。基于我们的实验数据，Opn5L1分子功能背后的预测机制如下：

1. 1.
   暗态特异性结合全反式视黄醛形成激活态。光感受后，视黄醛异构化为11-顺式构型以抑制G蛋白激活能力。
2. 2.
   Cys188接近视黄醛的C11形成共价加合物，导致视黄醛中C11=C12双键转化为单键。
3. 3.
   视黄醛中的C11-C12单键发生热旋转。
4. 4.
   Cys188-视黄醛加合物以反式构象解离，再生原始的暗态（激活态），恢复G蛋白激活能力。

众所周知，光-氧-电压（LOV）蛋白在植物和微生物中广泛存在，它们在光感受后在其发色团黄素和相邻的半胱氨酸残基之间形成加合物。在迄今为止表征的视蛋白中，视黄醛和半胱氨酸残基之间形成加合物是Opn5L1蛋白所独有的。然而，关于类视黄醇和半胱氨酸残基之间形成加合物可以促进类视黄醇热异构化的分子模型先前曾在RPE65蛋白中被提出。RPE65蛋白作为类视黄醇异构水解酶，在视网膜色素上皮中催化全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇。因此，RPE65蛋白是视觉循环的关键组成部分，也是