ARDitox：基于人工智能的TCR交叉反应表位计算预测平台推动更安全的细胞免疫疗法发展

《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》：Computational identification of cross-reactive TCR epitopes with ARDitox

本研究针对T细胞受体(TCR)疗法中致命的脱靶毒性问题，开发了ARDitox计算平台。该平台通过整合HLA呈递概率和TCR面向残基的理化特性相似性分析，成功预测了MAGEA3112-120、MAGEA3168-176等已知临床毒性表位，并发现NLGN4X131-139新型TCR的潜在脱靶靶点ADH1A。研究证实计算预测能有效弥补小鼠模型的局限性，为TCR疗法安全性评估提供了重要工具。

　　

在癌症免疫治疗蓬勃发展的今天，T细胞受体工程化T细胞疗法展现出令人瞩目的治疗潜力。然而，这一新兴领域却面临着严峻的安全挑战——某些经过人工改造的高亲和力TCR在临床试验中引发了致命的脱靶毒性事件。问题的根源在于TCR具有令人惊讶的交叉反应特性：它们能够识别序列差异巨大的肽段，且这种交叉反应性难以通过传统方法预测。更棘手的是，由于TCR具有严格的序列特异性，在小鼠模型中进行的临床前安全性研究往往会遗漏人类特异性的表位。

2013年发生的两起悲剧事件凸显了这一问题的严重性。在针对MAGEA3_112-120和MAGEA3_168-176表位的TCR疗法临床试验中，四名患者因心源性和神经毒性不幸死亡。事后研究发现，这些经过亲和力优化的TCR不仅识别目标肿瘤抗原，还交叉识别了表达在健康组织上的肽段，如心肌细胞中的Titin蛋白表位。令人担忧的是，引发毒性反应的脱靶表位与目标表位之间仅需共享5个氨基酸，这使得全面筛查变得异常困难。

传统的实验方法如X-扫描或丙氨酸扫描虽然有效，但面对人类蛋白质组中数以亿计的潜在肽段，显得力不从心。而动物模型由于物种差异（仅85%的蛋白质编码序列在小鼠中保守），无法完全模拟人类免疫系统的复杂性。正是为了突破这些瓶颈，来自德国癌症研究中心和Ardigen公司的研究团队开发了ARDitox这一创新型计算平台。

研究人员在《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》上发表的这项研究，展示了一个包含五个关键步骤的综合分析流程。该平台首先通过同源性搜索识别所有与目标表位共享至少5个氨基酸的潜在脱靶表位，随后纳入gnomAD数据库中频率超过1%的错义单核苷酸多态性变异。接着利用MHCflurry进行HLA结合亲和力预测，并结合内部开发的基于机器学习的人工智能模型评估表位呈递概率。最核心的创新在于引入了安全性评分系统，该系统基于TCR面向残基的理化特性相似性进行计算，最终整合GTEx和人类蛋白质图谱的组织表达数据，实现对脱靶风险的全面评估。

研究方法方面，作者主要采用了计算生物学分析（包括蛋白质组数据库搜索、变异整合和机器学习预测）、体外验证实验（使用Jurkat T细胞和BOLETH抗原呈递细胞共培养体系）以及统计学比较分析（包括TAA、病毒和移码突变表位的安全性评分分布比较）。

ARDitox识别已知交叉反应表位

研究人员通过对五个临床案例的系统验证，证明了ARDitox的预测能力。在案例1中，针对MAGEA3_112-120（KVAELVHFL）的TCR疗法曾导致患者出现神经毒性，ARDitox不仅成功识别出已知的MAGEA12、MAGEA8等交叉反应表位，还发现了EPS8L2_2339-347（SAAELVHFL）这一在脑中高表达的潜在毒性表位。所有24个安全性评分低于3.0的表位中，这些已知毒性表位均获得了最低可能得分0分。

案例2中，针对MAGEA3_168-176（EVDPIGHLY）的TCR引发的心肌毒性更是令人震惊。ARDitox从84个潜在脱靶表位中准确识别出Titin来源的表位ESDPIVAQY，其安全性评分同样为0，且表达分析确认其在心肌和肌肉组织中丰富存在。

值得注意的是，在案例3的NY-ESO-1_157-165（SLLMWITQV）分析中，ARDitox仅发现一个安全性评分低于3.0的表位（LRBA_657-665，FLLMFIKQL），这与该TCR在临床应用中良好的安全性记录相符。案例4中，ARDitox成功识别出AFP_158-166（FMNKFIYEI）TCR的已知脱靶表位RCL1_215-223（安全性评分2.5），但未预测出ENPP1表位——这与实验证据一致，因为该表位确实无法被加工和呈递。

ARDitox识别新靶点的交叉反应表位

在案例6中，研究团队将ARDitox应用于靶向NLGN4X_131-139（NLDTLMTYV）的新型TCR，该表位在胶质母细胞瘤中频繁上调。平台不仅识别出高度同源的NLGN4Y表位（安全性评分0），还发现了16个安全性评分低于5.0的潜在脱靶表位。体外实验验证显示，ADH1A_342-350和ADH1B表位SLDALITHV（安全性评分4.87）能够微弱激活T细胞，而NLGN4Y表位则引发强烈反应。特别重要的是，ADH1A的脱靶反应在小鼠模型中无法被检测，因为其小鼠同源基因Adh1来源的表位PLDPLITHV无法被呈递，这凸显了计算预测在跨越物种限制方面的独特价值。

ARDitox识别不同表位类别的OTE负担差异

通过大规模比较分析，研究人员发现肿瘤相关抗原表位产生的潜在脱靶表位数量（31,854个）显著多于病毒表位（22,279个）。虽然两组的安全性评分分布总体相似，但TAA表位在高风险表位（安全性评分<3）方面呈现显著富集（比值比4.48）。这一发现支持了自身抗原更易与人类蛋白质组存在同源性的理论假设。

更有趣的是，当比较TAA表位与移码突变产生的表位时，后者产生的潜在脱靶表位数量减少近10倍（336 vs 3,911），且无一表位的安全性评分低于3.0。这表明源于完全非自身序列的移码突变表位可能具有更优的安全性特征，为未来免疫治疗靶点选择提供了重要参考。

研究结论与意义

ARDitox的开发标志着TCR疗法安全性评估进入了一个新阶段。该平台通过整合多维度生物信息，实现了对脱靶毒性的系统性预测，其独特优势体现在几个关键方面：首先是全面性，不仅考虑常规蛋白质组，还纳入常见遗传变异；其次是精准性，基于人工智能的呈递预测和TCR面向残基的理化特性分析大大提高了预测准确性；最后是实用性，安全性评分系统为实验验证提供了明确的优先级别。

研究结果强调，对于TCR疗法的风险评估，需要综合考察三个关键指标：潜在脱靶表位总数、安全性评分低于3的高风险表位数量以及这些表位的组织表达谱。正如Titin案例所示，即使总体表位数量不多，但单个高风险表位在关键组织的表达就可能导致灾难性后果。

当然，ARDitox也存在一定局限性，如对罕见HLA类型的TCR面向残基判断可能不准确，以及存在一定比例的假阳性结果。然而，作为临床前安全筛查的上游工具，其价值在于大幅缩小实验验证范围，提高研发效率。特别值得注意的是，当结合实验数据（如X-扫描结果）时，ARDitox能够进行TCR特异性的脱靶预测，这使其成为连接靶点选择与最终疗法验证的重要桥梁。

这项研究的更广泛意义在于，它为细胞免疫治疗的安全性评估建立了新标准。随着ARDitox等计算工具的成熟，我们有理由相信，未来将会有更多安全有效的TCR疗法进入临床，最终实现精准免疫治疗的美好愿景。同时，该研究也提示移码突变表位作为相对安全的靶点类别，可能为下一代个体化癌症疫苗开发指明方向。