动物糖基转移酶家族54的进化分析揭示两个β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶家族的起源与功能分化

《iScience》：Evolutionary analyses of the animal glycosyltransferase family 54 reveals two β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase families

本研究针对N-糖基化分支合成途径的起源与功能组织机制这一长期悬而未决的问题，通过对230多个后生动物GT54相关基因的系统进化分析，首次揭示了脊椎动物中存在的七个MGAT4亚家族，并发现它们可分为两个具有不同底物特异性的深进化分支。该研究不仅阐明了GT54家族在后生动物中的进化轨迹，还通过生化实验证实了这两个分支分别具有α1,3-甘露糖基-糖蛋白β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶和α1,6-甘露糖基-糖蛋白β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶活性，为理解高尔基体糖基化机器的功能组织提供了重要见解。

　　

在真核生物的蛋白质翻译后修饰中，N-糖基化是最常见且普遍存在的一种修饰方式，它通过调控蛋白质的稳定性和功能，在细胞粘附、信号转导等生命过程中发挥着关键作用。其中，分支N-聚糖的结构多样性主要由GlcNAc分支数量的变化所决定，这种分支结构能够调节蛋白质与碳水化合物结合蛋白的分子相互作用。然而，尽管分支N-聚糖的生物合成途径具有重要意义，其起源和进化历史却一直是个未解之谜，特别是高尔基体中负责合成这些分支结构的酶机器的功能组织机制仍然难以捉摸。

在N-聚糖成熟过程中，β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶（MGAT4）负责在特定甘露糖残基上添加GlcNAc分支，这些酶被归类于CAZy糖基转移酶家族54（GT54）。虽然人类基因组中已知存在MGAT4A、MGAT4B、MGAT4C和MGAT4D四个成员，但它们之间的进化关系以及功能分化一直不清楚。更复杂的是，先前研究表明鸡MGAT4C样酶能够催化形成β1,4连接，将三支和四支N-聚糖转化为四支和五支结构，这一活性在哺乳动物中却不存在。这些发现揭示了脊椎动物中可能存在一类功能迥异的MGAT4酶亚群，同时也凸显了对GT54相关CAZymes进行清晰分类和命名的重要性。

为了揭示GT54家族的进化关系并深入理解人类酶的作用机制，研究人员开展了一项整合生物信息学和生物化学方法的研究。研究团队从103个后生动物基因组中鉴定出230多个GT54相关序列，通过基因结构分析、序列比对、分子系统发育和序列相似性网络等多种方法，系统研究了这些序列的进化关系。

研究人员采用的最大似然法系统发育分析揭示了GT54家族分为两个深根分支：一个包含MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D（ABD亚组），另一个包含MGAT4C、MGAT4E、MGAT4F和MGAT4G（CEFG亚组）。这两个分支的分化早于刺胞动物的出现（约8.24亿年前），而七个脊椎动物GT54直系同源群则是在脊椎动物出现后才形成的。序列相似性网络分析在比特分数阈值为700时也明确支持这两个主要亚组的存在。

在序列特征分析中，研究人员发现每个MGAT4亚家族在凝集素结构域和催化结构域都存在高度保守的肽段基序。凝集素结构域中鉴定出四个保守基序，而催化结构域则发现五个保守基序，其中包括GT-A折叠糖基转移酶中典型的DxD基序，该基序已知参与金属离子（如Mn²⁺）的协调和糖供体的结合。这些保守基序在ABD亚组中高度保守，而在CEFG亚组中进化较快，特别是在哺乳动物MGAT4E和MGAT4F蛋白中，这些基序发生了高度改变，提示这些哺乳动物GT54可能已经丧失了催化功能。

比较基因组学分析进一步阐明了GT54家族的进化关系。研究人员发现人类基因组中存在八个平行块，分别携带六个人类基因位点MGAT4EP和MGAT4FP、MGAT4A、MGAT4D、MGAT4B、MGAT4C以及已丢失的MGAT4G。保守同线性分析支持了MGAT4A、MGAT4B、MGAT4D和MGAT4C基因位点的进化关系，而祖先基因组重建方法最终证实了MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D进化枝与MGAT4C、MGAT4F和MGAT4G进化枝的共同起源。

功能分析方面，研究人员通过体外酶活性实验评估了代表每个亚组的小鼠、鸡和青鳉MGAT4蛋白的转移活性。实验结果表明，小鼠MGAT4A和MGAT4B以及青鳉MGAT4D能够以双支N-聚糖为底物，形成三支N-聚糖，而鸡MGAT4F则偏好以具有α1,6-Man上β1,6-GlcNAc的三支N-聚糖（即MGAT5产物）为底物，表现出GnT-VI样活性。令人惊讶的是，尽管先前未检测到人类MGAT4C的活性，但研究发现小鼠和鸡MGAT4C也具有较弱的酶活性。然而，小鼠MGAT4F和MGAT4E在这些底物上未显示出GnT-IV或GnT-VI样活性，这可能与这两个MGAT4序列中积累的变化有关。

为了探究哺乳动物MGAT4D活性丧失的原因，研究人员还构建了嵌合型小鼠MGAT4D蛋白，这些蛋白含有小鼠MGAT4A或MGAT4B或青鳉MGAT4D的凝集素结构域。然而，这些嵌合蛋白均未表现出酶活性，表明哺乳动物MGAT4D活性的丧失并非仅由凝集素结构域的缺失引起。

主要技术方法

本研究综合利用生物信息学分析（包括序列比对、系统发育重建、序列相似性网络和比较基因组学）、蛋白质结构建模与保守基序分析、分子克隆与细胞转染技术，以及高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等生化分析技术，对来自多个物种的MGAT4酶进行了功能表征。

两个深根GT54亚组和七个脊椎动物亚家族的存在

研究表明GT54基因仅限于后生动物中，在刺胞动物等早期后生动物分支中已存在多个拷贝，而在非后生动物外类群如领鞭毛虫、真菌和绿色植物中均未发现MGAT4相关序列。基因结构分析确定了两个多外显子基因集合，其中MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D基因显示15或16个编码外显子，而MGAT4C、MGAT4F、MGAT4E和MGAT4G基因的编码序列仅被分割为2到3个外显子。

比较基因组学阐明GT54家族的进化关系和功能分化

全基因组复制（WGD）事件为重复基因提供了重要来源，对物种进化产生了重大影响。研究人员通过同线性分析和祖先基因组重建，发现MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D进化枝与MGAT4C、MGAT4F和MGAT4G进化枝的共同起源。MGAT4G进化枝可能最早出现，是WGD-R1的结果，并在许多谱系中经历了基因失活和/或独立基因丢失。MGAT4C进化枝可能是在WGD-R2之后出现的，而MGAT4E可能起源于MGAT4F的串联复制事件，发生在哺乳动物祖先的基部。

功能分析揭示两个GT54亚组具有不同的底物特异性

酶活性实验表明，ABD亚组中的酶（MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D）是α1,3-甘露糖基-糖蛋白β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶，而CEFG亚组中的酶（MGAT4C、MGAT4E、MGAT4F和MGAT4G）是α1,6-甘露糖基-糖蛋白β1,4-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶，作用于三支N-聚糖。这些发现表明ABD亚组的GnT-IV样酶在时间上作用于β1,2-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶MGAT1（有时在MGAT2之后），而CEFG亚组的酶则作用于α1,6-甘露糖基-糖蛋白β1,6-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶MGAT5之后。

研究结论与意义

该研究通过对GT54 CAZymes的综合分析，在分支N-聚糖途径和后生动物进化方面取得了重要发现。虽然GT54在多细胞生物起源时的起源仍不确定，但研究揭示了后生动物早期存在两个具有不同酶特异性的GT54亚组（ABD和CEFG）。这两个GT54亚组或家族在脊椎动物出现和WGD轮次后进一步多样化，分别形成三个和四个进化枝。

脊椎动物ABD（包括MGAT4A、MGAT4B和MGAT4D）进化缓慢，支持了这些MGAT4和三支N-聚糖在脊椎动物中具有重要生物学功能的观点。另一方面，脊椎动物CEFG（包括MGAT4C、MGAT4E、MGAT4F和MGAT4G）在脊椎动物谱系中快速进化，在脊椎动物进化过程中经历了几次独立的基因复制和丢失事件。这些数据表明，在哺乳动物进化过程中，具有GnT-VI样活性的GT54功能丧失，提示这种N-聚糖分支机制可能在哺乳动物进化过程中受到宿主-病原体相互作用的塑造。

该研究还帮助全面解析了N-聚糖生物合成途径，阐明了几种GT54相关序列的分支能力和底物偏好，增进了我们对高尔基体膜中这种糖基化机制功能组织的理解。这些发现对于未来生物技术应用具有重要价值，包括为特定糖基化反应设计和改造MGAT4。考虑到分支N-聚糖对细胞粘附分子生物学功能的作用，可以推测GT54基因参与了整合素介导的粘附和信号传导机制，引发了单细胞向多细胞的转变，从而产生了后生动物。

总之，这项研究不仅揭示了GT54家族的深进化历史，还阐明了其功能分化机制，为理解糖基化途径的进化及其在生物过程中的作用提供了重要见解，对糖生物学研究和生物技术应用都具有深远意义。