智能吸入疗法：利用基于菊粉的多功能聚合物提升siRNA的疗效

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Smart Inhalation Therapy: Boosting siRNA Efficacy with Inulin-Based Multifunctional Polymers

本研究开发了一种新型菊粉基共聚物INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)，用于肺部siRNA递送。该材料通过分步合成赋予亲水性和阳离子特性，在低聚合物/siRNA质量比（R=5）下即可形成稳定纳米级polyplexes（<30 nm），具备高粘液穿透性和肺表面活性剂稳定性。实验表明其通过质子海绵效应促进胞内释放，细胞毒性低于50%，且在肺泡沉积实验中显示优异的呼吸可及性。该材料为慢性肺病（如COPD、CF）的siRNA治疗提供了高效递送平台。

　　基因沉默疗法（siRNA疗法）在治疗严重肺部疾病方面展现出巨大的潜力。然而，要实现高效的基因沉默，必须开发一种能够克服肺部物理和生物屏障的高效传递平台。本文介绍了一种基于低聚木糖（INU）的共聚物——INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)，旨在用于吸入式siRNA传递。通过逐步合成方法，首先将INU与二乙烯基砜（DVS）功能化，形成INU-VS，从而在总的INU重复单元中分别实现25%和5%的bAPAE与PMeOx的可控偶联。最终得到的共聚物展现出质子化胺基团，这对于核苷酸的复合形成至关重要。在较低的聚合物/siRNA重量比（R = 5）下，观察到稳定的siRNA聚复合物形成，其平均尺寸小于30纳米。电位滴定实验表明该共聚物具有良好的缓冲能力，而荧光显微镜研究显示pH依赖性的膜破坏，表明其在低pH条件下具有增强的内体逃逸潜力。在粘液和肺泡表面活性剂中的稳定性研究表明，聚复合物即使在高粘蛋白浓度（5 mg mL^–1）下仍保持完整，并表现出良好的粘液扩散性。对16-HBE细胞的生物相容性评估显示，该共聚物具有优异的细胞相容性，即使在高浓度下，细胞存活率仍超过80%。吸收实验确认了聚复合物的内化和siRNA释放。在MDA-MB-231-eGFP细胞上的实验显示了siRNA介导的沉默效应。总体而言，结合该聚复合物水分散液的优良气雾性能，这些发现突出了INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)作为吸入式siRNA载体的通用性和有效性，为未来呼吸道疾病的治疗应用奠定了基础。

### 1. 引言

囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和哮喘是肺部疾病，这些疾病以慢性炎症和进行性肺功能障碍为特征，严重损害患者的生活质量，每年导致约400万例死亡。目前，针对这些疾病的治疗手段仍然有限，现有的疗法主要是缓解症状和延缓疾病进展。研究已经揭示了这些疾病中某些基因的过度表达，这激发了对基于siRNA的治疗策略的兴趣。2018年，首款基于siRNA的疗法Onpattro获得批准，标志着该领域的重要进展。通过吸入方式将siRNA应用于肺部疾病治疗，可以实现肺部高局部浓度的RNA，同时减少全身降解和副作用。已有初步研究显示气雾化RNA在临床前实验中表现出积极的结果。

然而，吸入式RNA制剂需要具备特定的特性，以到达呼吸道的深层区域，如气动直径在0.5至5微米之间，并克服肺部的障碍，如天然屏障和清除机制，这些通常会阻碍有效传递。首先遇到的屏障是覆盖气道的黏液层，这是一种水凝胶，通过空间阻碍和粘附相互作用（如静电、疏水和氢键）捕获吸入的颗粒，帮助其通过粘液纤毛清除机制（MCC）被移除。在肺泡区域，肺泡表面活性剂成分是另一种siRNA制剂的障碍，因为它们可以吸附在颗粒上，改变其体内命运。此外，气管上皮细胞本身也是屏障，由于紧密连接和低内吞活性，限制了siRNA的传递效率。这些挑战因疾病严重程度和类型而异，其中在COPD和CF中增加的黏液粘度和黏蛋白超分泌进一步阻碍传递。随着疾病进展，肺部的吸入功能也会下降，这会限制基于吸入的治疗效果。

因此，为了实现高效的吸入式siRNA传递，纳米级的传递系统是合适的载体，以允许穿透黏液层并保护siRNA免受核酸酶降解，增强细胞摄取并延长其在肺部的停留时间。其中，基于聚合物的纳米载体因其生物相容性、稳定性和多功能性而备受关注。这些聚合物通常合成以具有正电荷，通过静电相互作用与核酸结合。为了减少聚复合物与肺部液体（如黏液和表面活性剂）的相互作用，可以通过接枝亲水性聚合物（如聚乙二醇）调节载体的亲水性。在这些类似材料中，聚（2-噁唑啉）（POx）表现出类似PEG的隐形特性，同时具有快速清除和较低组织积累的优势。

鉴于这些因素，本研究聚焦于开发一种基于聚复合物的吸入式siRNA制剂。聚合物成分是从低聚木糖（INU）开始合成的，INU是一种天然的、水溶性的、生物相容的、非免疫原性和非抗原性的多糖，已被用于开发高性能的聚合物基因载体。为了赋予正电荷并增强亲水性，我们选择了1,2-双（3-氨基丙基氨基）乙烷（bAPAE）作为功能基团，而聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMeOx）则作为亲水性基团。最终获得的新半合成接枝共聚物在吸入治疗中作为siRNA载体的潜力被评估，包括与肺部液体成分的相互作用、对气管上皮细胞的内化能力以及基因沉默能力。

### 2. 结果与讨论

#### 2.1. INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)共聚物的合成与表征

合成聚合物作为siRNA载体是可行的候选者，因为其结构和功能特性可以被调节以提供特定的特性，以满足特定siRNA序列的复合需求。本文描述了一种新型低聚木糖（INU）基共聚物的合成，用于肺部siRNA的吸入传递。选择INU作为起始聚合物是因为它是一种广泛用于纳米医学和再生医学的天然多糖。为了赋予聚合物与遗传物质结合的能力，我们选择了二乙烯基砜（DVS）作为功能基团，以实现可控制的偶联。通过一种简单而高效的合成策略，首先在二甲基甲酰胺（DMF）中将INU进行共价功能化，然后在水性介质中与PMeOx混合，并转移至含有过量bAPAE的有机溶液中，以防止聚合物链的交联。最终得到的INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)共聚物表现出质子化胺基团，这对于核酸复合和缓冲性能至关重要，而缓冲性能在促进内体逃逸中起着关键作用。

为了研究该共聚物的缓冲性能，进行了电位滴定实验。INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的滴定曲线显示出典型的多质子碱特性，在pH 7.5至5的范围内，曲线斜率逐渐减少，这表明聚合物提供了中等的、分布式的缓冲作用，其最强的缓冲性能发生在次级胺质子化占主导的pH范围内。曲线没有明显的转折点，表明该聚合物没有单一主导的pK_a，而是具有多个弱碱性位点，形成广泛的缓冲区域。

在pH 7.4（细胞质pH）和pH 5（内体pH）范围内，通过体外实验研究了该共聚物对生物膜的相互作用。使用黄色噁唑啉作为荧光探针，区分健康细胞与正在经历凋亡或已经死亡的细胞，因为凋亡细胞的膜通透性增加。实验结果表明，只有在pH 5条件下观察到荧光探针的更高内化，这证实了该共聚物能够在酸性条件下充当膜渗透剂，这可能为内体逃逸提供了一种潜在机制。

#### 2.2. siRNA-共聚物复合研究与聚复合物表征

为了评估合成的共聚物对siRNA的复合能力，将siRNA在0.2 mg mL^–1的水性分散液中与不同浓度的INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)共聚物混合，以获得不同的聚合物/siRNA重量比（R）。通过琼脂糖凝胶电泳和动态光散射（DLS）测量对形成的聚复合物进行了表征。结果显示，在R = 5时，共聚物能够稳定地与siRNA复合，且在pH 7.4下，质子化的共聚物物种（图S1）显示出与siRNA结合的潜力。随着R的增加，聚复合物的zeta电位从负值逐渐变为正值，而在所有R值下，聚复合物的平均尺寸均低于30纳米，表明即使在zeta电位接近中性时，也没有发生聚集。这种行为归因于聚复合物表面的PMeOx，其作为保护胶体，防止了聚复合物的聚集。通过原子力显微镜（AFM）对¹H NMR分析的结果进行了验证，进一步确认了聚复合物的尺寸和形态特征。

因此，所有这些初步结果表明，INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)共聚物具有出色的遗传物质复合能力，所需聚合物含量较低，形成平均尺寸小于30纳米、表面电荷低于20 mV的聚复合物。这些特性对于穿透高粘度和过滤屏障的肺部环境至关重要，如肺部黏液。

#### 2.3. 聚复合物在肺部液体中的稳定性

为了评估基于INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的聚复合物在局部肺部传递中的适用性，我们研究了其在黏液和肺泡表面活性剂成分中的稳定性。由于黏蛋白是肺部黏液的主要成分，含有负电荷的硫酸和唾液酸基团，我们评估了黏蛋白与siRNA之间的多阴离子交换是否可能发生，这可能导致siRNA在到达靶点前从聚复合物中释放。为此，测试了两种不同的黏蛋白浓度，因为黏液的组成在疾病和其进展阶段会有所不同。特别是，通过电泳实验评估了在1和5 mg mL^–1黏蛋白浓度下，多阴离子交换是否发生，而多阴离子交换可能引起siRNA的提前释放。结果显示，在¹H NMR分析下，当聚合物/siRNA重量比（R）等于7.5时，未发生多阴离子交换，这表明在病理条件下黏蛋白含量较低时，这些聚复合物的稳定性较高。然而，当黏蛋白含量增加5倍时，只有在R = 15时，才能防止siRNA的提前释放，这表明通过调节聚复合物的组成比例，可以根据病理特征调整其性能，使其适用于治疗黏蛋白分泌过多的疾病，如囊性纤维化（CF）。

此外，考虑到黏蛋白不仅可能导致多阴离子交换，还可能与聚复合物形成聚集，我们进行了浊度分析，以研究在不同黏蛋白浓度下的聚复合物稳定性。在实验条件下，当R = 7.5和R = 15时，聚复合物表现出良好的稳定性，因此能够用于评估其在黏蛋白中的相互作用。结果表明，当R = 15时，黏蛋白浓度为5 mg mL^–1，没有明显的聚复合物-黏蛋白相互作用，因为聚复合物表面的PMeOx形成了一层更厚的亲水壳，有效地屏蔽了与黏蛋白链的相互作用。为了确认聚复合物的粘液扩散潜力，我们使用了CF人工黏液（CF-AM）进行扩散实验，CF-AM表现出与病理黏液相似的流变特性。结果显示，当R = 15时，聚复合物能够在5小时内扩散到接受室，其数量约为总数量的80%。

考虑到肺部屏障不仅包括气道的黏液层，还包括肺泡表面活性剂，我们还评估了在肺泡表面活性剂（Curosurf）存在下的聚复合物稳定性。结果表明，无论R = 7.5还是R = 15，聚复合物在肺泡表面活性剂中保持稳定，5小时后未检测到siRNA的释放。此外，为了确认聚复合物对核酸酶的保护能力，我们评估了其在RNase介导的降解中的表现。结果显示，经过RNase A处理并随后用肝素解离聚复合物后，siRNA的条带仍然与对照相当，而未载siRNA的条带完全消失，表明自由siRNA已被完全降解。

综上所述，siRNA与INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的复合能够形成在高黏蛋白浓度下稳定的聚复合物，能够扩散至病理黏液，并保护siRNA免受降解，表明这些聚复合物可以用于吸入式传递。

#### 2.4. 聚复合物的生物表征

聚复合物的生物表征在人类气管上皮细胞（16-HBE）上进行，因为吸入后，这些细胞是其首先接触的细胞，同时也是管理肺部炎症的潜在靶点。通过MTS实验评估了INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)共聚物的细胞相容性，结果显示在0.005至0.5 mg mL^–1的共聚物浓度下，细胞存活率均超过80%。在相同的实验条件下，使用不同浓度的聚复合物进行细胞存活率实验，也显示了良好的细胞相容性，表明即使在较高浓度下，聚复合物也不会显著影响细胞存活。

此外，为了评估这些聚复合物是否能够有效内化到气管上皮细胞中，我们使用了标记为AlexaFluor488的聚复合物和标记为AlexaFluor647的siRNA进行荧光摄取实验。结果显示，在24小时的培养后，聚复合物和siRNA的荧光信号均被检测到，且两种荧光探针的定位并不完全重叠，这表明siRNA可能在细胞内环境中与聚复合物分离，从而可能触发RNA干扰的分子机制。相比之下，未结合的siRNA没有荧光信号。

在进一步评估这些聚复合物的基因沉默能力时，我们使用了MDA-MB-231-eGFP细胞作为模型，通过siGFP作为siRNA模型，研究了其对eGFP基因表达的抑制作用。结果显示，聚复合物在¹H NMR分析下表现出显著的基因沉默效果，其中在R = 7.5时达到约40%的抑制，而在R = 15时达到约30%的抑制。这一结果可以解释为，在R = 15时，siRNA从复合物中解离的能力较低，因此可能在有效与靶点相互作用前释放较少。同时，使用了随机siRNA序列（siNC）进行实验，这些聚复合物没有表现出基因沉默效果，这进一步证实了沉默效应是由siGFP序列引起的。与脂质体（Lipofectamine）相比，这些聚复合物在基因沉默活性方面稍逊一筹，但不会显著降低细胞存活率，而脂质体则将细胞存活率降低至约50%。

这些结果成功证明了基于INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的载体能够释放siRNA并诱导eGFP基因的体外抑制，证实了其作为肺部siRNA传递载体的优秀潜力。

#### 2.5. 体外肺部药物沉积研究

为了评估所制备的聚复合物分散液穿透支气管树的潜力，我们使用Andersen Cascade Impactor（ACI）进行了体外气雾化性能测试。结果表明，约40%的吸入剂量沉积在ACI的第3至第7阶段，这对应于支气管和肺泡区域。该制剂表现出良好的气雾化性能，细颗粒分数（FPF）为61.7 ± 0.28%，表明其适合深部肺部沉积。质量中位气动直径（MMAD）测量为3.91 ± 0.06微米，几何标准偏差（GSD）为1.84 ± 0.04微米，证实了大部分剂量落在可吸入的尺寸范围内。此外，对从ACI中回收的样品进行动态光散射（DLS）测量，未发现聚复合物尺寸发生显著变化，仍保持在约27纳米，PDI为0.328。这些结果突出了该聚复合物制剂在肺部siRNA传递中的潜力，支持其在吸入式治疗策略中的应用。

### 3. 结论

综上所述，我们成功合成并表征了一种新型的基于低聚木糖（INU）的共聚物，INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)，旨在通过吸入方式传递siRNA。这种非常灵活的合成方法利用了先前的二乙烯基砜（DVS）功能化，使该共聚物在一步反应中获得亲水性和阳离子特性，从而实现了高效率的胺基和PMeOx链的接枝。该共聚物具有独特的阳离子和亲水特性，其胺基富集区域负责siRNA的复合，而亲水的PMeOx链则赋予其稳定性，防止在生理条件下聚集。

共聚物的结构和功能特性，以及所选siRNA模型的特性，使得其能够自聚集形成小而窄分布的结构，这在高粘度和过滤结构的环境中尤为理想。我们的研究结果表明，该聚合物不仅能够在较低的聚合物/siRNA重量比下有效复合siRNA，还能够形成尺寸小于30纳米的稳定聚复合物，这是有效穿透黏液屏障和肺泡液体的关键特征。此外，该共聚物的缓冲能力通过质子海绵效应增强内体逃逸，这是siRNA细胞内传递的关键步骤。pH依赖性的膜破坏进一步支持了该共聚物促进siRNA细胞质释放的假设，提高了其生物利用度和治疗潜力。

此外，聚复合物在肺部黏液和表面活性剂中表现出良好的稳定性，表明其适合肺部传递。重要的是，该共聚物能够显著保护siRNA免受酶解，确保其在给药后保持生物活性。细胞摄取研究证实了聚复合物被气管上皮细胞高效内化，且与自由siRNA相比，细胞内的siRNA水平显著增加。这些结果进一步支持了该共聚物在体外对eGFP基因沉默的潜力，表明其作为肺部siRNA传递载体的优异性能。

### 4. 实验部分

#### 4.1. 材料

低聚木糖（INU）从 Dahlia 根茎中获得（M_w = 5 kDa），二乙烯基砜（DVS）纯度≥98.0%，二甲基甲酰胺（DMF），甲醇（MeOH），三乙胺（TEA），二乙醚，二氯甲烷，丙酮，Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水（DPBS），氢氧化钠（NaOH），盐酸（HCl），HEPES，1,2-双（3-氨基丙基氨基）乙烷（bAPAE），苯腈，2-甲基-2-噁唑啉（MeOx），BOC-哌嗪，琼脂糖，猪胃黏蛋白（Type II），牛下颌腺黏蛋白，脱氧核糖核酸（DNA），二乙基三胺五乙酸（DTPA），RPMI 1640 氨基酸溶液，蛋黄乳剂，氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl），MISSIONsiRNA 荧光通用阴性对照（Cy5），和RNase A均从Merck（意大利）获得。二乙烯基砜中的氢醌（作为稳定剂）通过中性氧化铝柱去除后使用。

所有用于生物表征的材料均从Merck（意大利）购买。

#### 4.2. 细胞培养

人类气管上皮细胞（16-HBE）由伦巴第和艾米利亚-罗马涅的动物防疫研究所提供。16-HBE细胞在最小必需培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中培养，补充胎牛血清（FBS，10体积%），l-谷氨酰胺（2 mM），放线菌素B（2.5 μg mL^–1），链霉素（100 μg mL^–1），和青霉素（100 U mL^–1）（Sigma-Aldrich，米兰，意大利）。乳腺癌细胞（MDA-MB-231）稳定表达增强绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因作为模型，使用siGFP作为siRNA模型，从CliniSciences S.r.l.（意大利）购买，并在相同的培养基中培养，补充放线菌素（0.6 μg mL^–1）。

所有细胞系均在标准条件下培养（相对湿度95%，5% CO₂，37 °C）。

#### 4.3. 通过阳离子开环聚合（CROP）合成甲基化聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMeOx）

为了达到5 kg/mol的分子量，合成聚（2-甲基-2-噁唑啉）-哌嗪-BOC（PMeOx-Pip-Boc）。所有试剂和溶剂均经CaH₂处理并真空蒸馏，然后在适当的储存条件下使用。简要来说，将360 mg的MeOTf（1当量）加入一个预先干燥并用氩气充填的烧瓶中，然后用42 mL的苯腈稀释，以获得约3 M的单体浓度。之后加入10.7 g的MeOx（58当量），并在120 °C下搅拌3小时。冷却后，加入1.23 g的1-BOC-哌嗪（3当量），溶解在3.5 mL的苯腈中，并在50 °C下搅拌过夜。最终通过在冷二乙醚（0 °C）中沉淀从反应混合物中分离出聚合物，然后通过离心和用二乙醚洗涤五次，最后在减压下干燥。所得产物（产率约为初始单体重量的97%）通过¹H NMR和SEC分析进行表征。

#### 4.4. ¹H NMR分析

PMeOx-Pip-Boc（300 MHz，CDCl₃，25 °C，TMS）的¹H NMR谱显示：δ 1.44–1.46（多重峰，9H，（CH₃)₃CO），2.07–2.13（多重峰，174H，[CH₃CON]–），2.94，3.03–3.05（多重峰，3H，CH₃[N–CH₂CH₂]–），3.45–3.47（多重峰，232H [–CH₂CH₂N–]）。

#### 4.5. INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的合成

300 mg的INU-VS溶解在3 mL的超纯水中。完全溶解后，加入360 mg的PMeOx（在1.5 mL的超纯水中溶解），并用1 N NaOH调节反应pH至10，然后在搅拌下过夜。次日，将反应混合物加入bAPAE溶液（1 g在75 mL的DMF中）中，并在搅拌下过夜。之后，通过旋转蒸发器去除部分溶剂，将体积减少到约三分之一，并随后在二乙醚/DCM（2:1）中沉淀。沉淀物通过离心分离，并用二乙醚洗涤五次，最后在减压下干燥。所得产物（产率约为初始聚合物重量的98%）通过¹H NMR和SEC分析进行表征。

#### 4.6. 体积排阻色谱（SEC）

SEC分析使用PolySep-GFC-P4000柱（PHENOMENEX），在30 °C下进行，连接到Agilent 1260 Infinity多检测器GPC/SEC系统，并使用0.15 M柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5）作为洗脱液，流速为0.8 mL/min。通过使用聚乙二醇标准品制作校准曲线。

#### 4.7. INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)的电位滴定

30 mL的INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)（1 mg mL^–1）在氩气下滴定，使用0.05 N HCl直到pH 3。随后，使用0.05 N NaOH再次滴定。相同条件用于滴定等量的bAPAE。为了稳定离子强度，向混合物中加入0.1 N除气NaCl溶液。在滴定前，使用Jenway差示电位计对标准缓冲液（2.50 ± 0.01 < pH < 10.00 ± 0.01）进行校准。

#### 4.8. 膜破坏研究

16-HBE细胞在8孔Nunc Lab-Tek室式盖玻片上培养至细胞密度为10,000 cells/well。次日，将DPBS（pH 7.4）或20 mM MES（pH 5.5，130 mM NaCl）中的INU-VS-g-(PMeOx; bAPAE)（5 μg mL^–1）加入细胞中。20分钟后，每孔用无菌DPBS洗涤，然后加入1 μM YO-PRO1进行10分钟的处理，并在室温下用4%甲醛固定。通过倒置荧光显微镜（Axio Cam MRm，蔡司）观察细胞，并使用AxioVision软件分析图像。同时，空白对照实验也使用DPBS（pH 7.4）或20 mM MES（pH 5.5，130 mM NaCl）进行。

#### 4.9. 聚复合物与黏蛋白的相互作用评估

通过浊度实验评估了聚复合物与黏蛋白的可能相互作用。将60 μL的聚复合物与30 μL的siRNA 0.1 mg mL^–1混合，以获得聚合物/siRNA重量比（R）等于7.5和15的聚复合物。随后，加入60 μL的黏蛋白分散液（2 mg mL^–1或10 mg mL^–1），在37 °C下孵育5小时。通过琼脂糖凝胶电泳分析聚复合物的稳定性。作为对照实验，用10 mM无核酸酶HEPES缓冲液（pH 7.4）代替黏蛋白分散液。

#### 4.10. 聚复合物的粘液扩散性评估

为了评估聚复合物穿透CF-AM层的能力，我们使用了供体/受体系统。CF人工黏液（CF-AM）通过混合50 mg DNA、25 mg猪胃黏蛋白（Type II）、0.0295 mg DTPA、0.1 mL RPMI 1640 氨基酸溶液、25 μL蛋黄乳剂、25 mg NaCl和11 mg KCl，在5 mL无DNase水中的最终体积制备。将MilliCell细胞培养插入件（24孔，孔径0.4 μm）放置在24孔板中，加入600 μL无核酸酶HEPES缓冲液（pH 7.4）。然后，将30 μL的聚复合物（含100 nM siRNA）沉积在CF-AM层上。系统在37 °C下连续搅拌（50 rpm）。每小时测量受体介质中的荧光强度，以490 nm为激发波长，515 nm为发射波长。使用不同浓度的聚复合物分散液作为标准。每项实验进行三次，所得数据用于计算细颗粒分数（FPF %），定义为直径小于5.0微米的发射剂量百分比。此外，还计算了质量中位气动直径（MMAD）和几何标准偏差（GSD）。

### 4.11. 体外肺部药物沉积

为了评估聚复合物水分散液的气雾化性能，我们使用了Andersen Cascade Impactor（ACI）（InPharmaTEC，Cogliate（MB），意大利）进行体外研究。在使用前，将ACI冷却至4 °C，持续90分钟以冷却设备并最小化加热蒸发对雾化液滴的影响，这可能导致液滴收缩并影响沉积行为。气雾化研究中，将2.5 mL的聚复合物分散液加入到设备的样品室中，其中含有200 μL的聚复合物分散液（聚合物/siRNA重量比R = 15），并按照ACI的29 L/min配置进行7分钟的气雾化。通过表征各阶段的沉积情况，评估了聚复合物的沉积特性。最终，从每个阶段中回收聚复合物分散液，并测量其荧光强度以确定细颗粒分数（FPF %）和质量中位气动直径（MMAD）及几何标准偏差（GSD）。