抑制人α-淀粉样蛋白聚集：计算机模拟与体外研究

《ACS Omega》：Inhibition of Human Amylin Aggregation: In Silico and In Vitro Studies

本研究通过体外实验和计算模拟，评估了1-苯基氨基-2-羟基烷基多靶点定向配体（MTDLs）对Amylin聚集的抑制作用。发现化合物18和22显著抑制Amylin自组装，其中22的IC50值最低（2.71 μM）。DLS显示抑制剂使聚集颗粒尺寸保持在10 nm以下，荧光淬灭表明其通过疏水作用稳定α螺旋结构，抑制β折叠片层形成。分子动力学模拟证实化合物18能更持久地结合并稳定Amylin构象，减少毒性。该成果为糖尿病和阿尔茨海默病治疗提供了新方向。

　　人类胰岛淀粉样蛋白（hIAPP），也被称为胰岛素样肽，是一种调节血糖水平的关键内分泌激素。在病理状态下，hIAPP会发生构象变化并形成淀粉样沉积物，这在2型糖尿病（T2D）和阿尔茨海默病（AD）的发病机制中扮演着重要角色。在本研究中，我们探讨了1-苯甲氨基-2-羟基烷基衍生物作为hIAPP聚集抑制剂的潜力。这些化合物之前已被证明对AD中的淀粉样β蛋白（Aβ）聚集具有活性。我们通过ThT和DLS实验确定了化合物18和22是活性最强的衍生物，它们对hIAPP聚集的抑制作用具有3.04和2.71 μM的IC50值。这些化合物保留了小尺寸的寡聚体，其细胞毒性显著低于对照组。荧光猝灭实验表明，化合物18和22显著猝灭了hIAPP的内源性荧光，但未改变其发射光谱，这表明其结构发生了变化，但Tyr37区域未发生显著改变。结合和热力学分析表明，这些化合物与hIAPP之间的相互作用主要由疏水力驱动。一项计算研究比较了化合物18（最有效的）和化合物9（最不活跃的）在ThT实验中的行为。总体而言，化合物18与hIAPP形成更多相互作用，并在模拟中保持更长时间的结合，更频繁地稳定α-螺旋片段。这种稳定作用可能有助于延缓与淀粉样生成相关的β-片层结构的形成。我们的研究为hIAPP聚集过程提供了新的见解，并可能为设计更有效的聚集抑制剂提供参考。

hIAPP在生理和病理过程中的重要性不可忽视。它不仅参与血糖调节，还影响其他多种生理功能，如抑制餐后胰高血糖素释放、减缓胃排空、促进葡萄糖吸收、增强胰岛素作用以及维持能量稳态。然而，当hIAPP发生异常构象变化时，它会从可溶状态转变为不可溶状态，导致淀粉样沉积物的形成。这些沉积物是T2D中胰腺病理变化的重要标志。与此同时，AD的病理特征包括淀粉样β蛋白在脑部形成沉积物，这些沉积物主要由Aβ40和Aβ42异构体组成。尽管两种疾病的淀粉样沉积物在组成上有所不同，但许多研究表明，hIAPP和Aβ肽在氨基酸序列和构象特性上存在相似性，特别是在形成β-片层结构的序列中。此外，研究表明，hIAPP可以加速Aβ的聚集，这提示了两者之间可能存在协同作用。这些发现表明，研究hIAPP的聚集机制对于理解T2D和AD的共通性病理特征至关重要。

hIAPP的聚集过程是一个复杂的过程，从单体开始，逐渐形成寡聚体，最终成熟为淀粉样纤维。非极性残基形成的疏水表面是单体相互作用的关键驱动因素。此外，芳香族氨基酸之间的π-π堆积作用，特别是Phe15、Phe23和Tyr37残基，对hIAPP的自组装和分子识别具有重要作用。部分折叠的中间体进一步组装成结构更复杂的寡聚体，作为纤维的核心。由残基20-29形成的疏水表面对于纤维的形成至关重要。随着寡聚化的进展，肽间相互作用导致了β-链的网络结构。成熟的hIAPP纤维由平行排列的β-片层组成，氢键方向垂直于两条链。Phe15、Phe23和Tyr37这三种芳香族残基被认为对形成稳定的纤维是必要的。

为了探索hIAPP聚集抑制剂的潜在作用，我们采用了多种实验方法，包括ThT荧光实验和DLS实验。ThT实验通过监测荧光强度的变化来评估hIAPP的聚集情况，而DLS实验则通过测量粒子的大小和分布来检测聚集的进展。我们发现，化合物18和22对hIAPP聚集具有显著的抑制作用，其IC50值分别为3.04 μM和2.71 μM。这些化合物保留了小尺寸的寡聚体，其细胞毒性显著低于对照组。荧光猝灭实验显示，化合物18和22显著猝灭了hIAPP的内源性荧光，但未改变其发射光谱，这表明其结构发生了变化，但Tyr37区域未发生显著改变。结合和热力学分析表明，这些化合物与hIAPP之间的相互作用主要由疏水力驱动。通过计算研究，我们发现化合物18在ThT实验中与hIAPP形成更多相互作用，并在模拟中保持更长时间的结合，更频繁地稳定α-螺旋片段。这种稳定作用可能有助于延缓与淀粉样生成相关的β-片层结构的形成。我们的研究为hIAPP聚集过程提供了新的见解，并可能为设计更有效的聚集抑制剂提供参考。

为了进一步了解化合物18和22的作用机制，我们还进行了荧光猝灭实验。通过观察荧光强度的变化，我们发现这些化合物能够显著猝灭hIAPP的内源性荧光，但不会改变其发射光谱。这表明化合物与hIAPP的相互作用主要通过结构变化实现，但不会显著改变Tyr37区域的极性。此外，我们还分析了结合常数和热力学参数，以评估化合物与hIAPP之间的相互作用。结果显示，这些化合物与hIAPP之间的相互作用主要由疏水力驱动，并且随着温度的升高，结合的稳定性也随之增强。这一发现为理解化合物在生理条件下的抑制作用提供了依据。

在细胞毒性实验中，我们发现化合物18和22能够显著提高胰岛素1E细胞的存活率，表明它们能够有效防止hIAPP对胰岛细胞的毒性作用。这一结果进一步验证了化合物在抑制淀粉样沉积方面的潜力。此外，我们还通过分子对接和分子动力学模拟研究了化合物18和9在不同hIAPP系统中的行为。分子对接显示，化合物18在大多数系统中与hIAPP形成更多相互作用，而化合物9则较少形成π-π相互作用。分子动力学模拟进一步揭示了化合物18能够稳定hIAPP的α-螺旋结构，而化合物9则可能导致α-螺旋的破坏，促进其向其他结构如β-片层的转变。这一发现为理解化合物在抑制hIAPP聚集中的作用机制提供了重要的线索。

我们的研究结果表明，1-苯甲氨基-2-羟基烷基衍生物在抑制hIAPP聚集方面具有显著的潜力。通过结合实验和分子模拟，我们发现这些化合物能够通过多种机制干预hIAPP的聚集过程，包括稳定α-螺旋结构、减少寡聚体形成、降低细胞毒性等。此外，化合物18和22的结构特性，如较大的疏水基团和较高的结合常数，使其在抑制hIAPP聚集方面表现出更强的活性。这些发现不仅为hIAPP聚集机制提供了新的视角，还为开发针对淀粉样沉积物的新型抑制剂提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索这些化合物在体内的作用机制，以及它们在其他淀粉样疾病中的潜在应用。