光子晶体微阵列辅助的即时检测技术：用于快速便捷地检测微量白蛋白尿

《ACS Omega》：Photonic Crystal Microarray–Assisted Point-of-Care Testing for Rapid and Convenient Detection of Microalbuminuria

糖尿病肾病（DKD）早期诊断依赖微量白蛋白尿（mALB）检测，但现有方法存在灵敏度不足、操作复杂等问题。本研究开发了一种基于光子晶体微阵列的点-of-care检测平台，通过双抗体夹心免疫分析结合光子晶体结构的光学增强效应，显著提升检测灵敏度和分辨率。平台检测限低至19.5 pg/mL，准确率达92.9%，10分钟内完成检测，具备便携、低成本优势，适用于居家监测和临床连续性评估。

　　糖尿病肾病（DKD）是2型糖尿病最严重的并发症之一，对患者的发病率和死亡率产生显著影响。作为临床验证的生物标志物，微白蛋白尿（mALB）在DKD的早期诊断和疾病进展预测中扮演着关键角色。然而，现有的床旁检测（POCT）方法在检测白蛋白时常常面临灵敏度不足和操作复杂的问题。为了解决这些问题，研究团队开发并评估了一种完全印刷的、集成光子晶体的微阵列辅助POCT平台，专门用于快速、精确地检测mALB。该系统利用聚合物乳胶微球作为信号增强载体，这些微球在光学特性上与检测荧光探针兼容。通过利用光子晶体结构固有的光子带隙和光子局域效应，该平台显著增强了免疫分析中的荧光信号，从而大幅提升了检测的灵敏度和分辨率。

在检测方法上，该平台采用了双抗体夹心免疫分析法，通过特异性抗原-抗体结合和精确的定量分析实现高灵敏度检测。使用临床尿样进行验证，展示了该平台在诊断上的高效性。整个分析过程可以在10分钟内完成，表现出荧光水平与mALB含量之间良好的线性关系。该平台实现了19.5 pg/mL的检测限和高达92.9%的准确性。进一步的70份临床尿样验证表明，该平台表现出良好的诊断性能，具有高灵敏度、特异性和操作稳定性。综上所述，基于光子晶体微阵列的POCT系统为DKD的早期诊断和长期疾病监测提供了一种灵敏、准确且高效的方法。其便捷性和可携带性使其非常适合频繁评估和长期患者护理，可能提高诊断效率并降低医疗成本。

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病患者常见的微血管并发症之一，其死亡率高于未发生并发症的糖尿病患者。长期高血糖会导致DKD患者出现肾小球高滤过和高血压，这会损害肾小球滤过屏障并影响肾脏功能。当疾病发展到终末期肾衰竭时，患者可能会出现严重的尿毒症和肾功能衰竭，若无透析或肾移植，可能危及生命。因此，早期诊断和及时干预对于减缓DKD的进展至关重要。对于老年人而言，定期监测DKD相关生物标志物尤为重要，因为这有助于区分年龄相关的肾功能下降与病理性的肾脏损伤，从而实现及时的医疗干预。尿液中白蛋白的泄漏是DKD的早期临床指标之一。由于肾小球滤过功能受损和肾小管重吸收能力下降，原本在血液中丰富的白蛋白可能在尿液中出现异常升高。根据KDIGO指南，24小时内尿液白蛋白水平在30-300 mg或随机尿液样本中在20-200 mg/L之间，表示微白蛋白尿（mALB，A2阶段），而超过300 mg/天则表示巨白蛋白尿（A3阶段）。因此，mALB的检测广泛应用于常规健康检查、肾脏疾病临床诊断和DKD患者的快速监测中。

目前用于mALB定量分析的方法包括传统的免疫分析、液相色谱和微流控装置，这些方法依赖于复杂的仪器和专业的操作人员才能获得准确的结果。然而，这些方法往往耗时且操作繁琐，对设备和操作人员提出了较高的要求。相比之下，基于纸张的检测方法利用含溴的磺酸酞嗪染料（如溴酚蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫）能够在现场进行定性或半定量检测，因其操作简便和快速检测的特性而受到青睐。然而，传统实验室方法在连续临床监测中的应用仍然受到限制。此外，基于胶体金的检测方法虽然在结合仪器的情况下能够实现半定量分析，但其临床适用性和可扩展性仍需进一步研究。因此，患者需要频繁前往医疗机构进行检测，并接受重复的医疗咨询，以获得准确的诊断结果。

为了应对上述挑战，近年来，点对点检测（POCT）技术逐渐受到关注。其主要优势在于能够在多种环境中进行诊断测试，包括家庭、床边和紧急情况。然而，现有的POCT方法在检测白蛋白时仍然存在可靠性不足和分析精度不高的问题，这限制了其在连续临床监测中的应用。基于光子晶体（PC）的检测技术因其独特的光学特性，如选择性反射特定波长的光和增强免疫分析中的荧光信号，受到了广泛研究。通过与双抗体夹心免疫分析相结合，光子晶体能够高效地反射特定波长的光，从而显著提升荧光信号并提高检测的精度和速度。该创新方法为mALB的精确和高效检测提供了巨大潜力。

本研究提出了一种完全印刷的聚合物基光子晶体微阵列检测装置，能够实现mALB的实时快速检测。该装置的关键创新在于利用聚苯乙烯（PS）微球，这些微球能够在疏水性塑料基底上自组装成2×2 mm的光子晶体阵列。这些微球通过表面修饰的羧基基团高效地固定mALB捕获抗体（cAbs），从而确保特异性靶标识别。该系统的一个重要特点是将光子晶体的带隙精确地与荧光探针的发射波长对齐，从而显著增强靶标荧光信号并提高检测灵敏度。在检测过程中，只需10 μL的尿液样本与Cy5标记的检测抗体（dAb）混合后滴加到微阵列上，即可在10分钟内完成检测并实现准确的定量分析。该技术集成了简单的制造过程和高效的检测能力，为临床诊断提供了一种新颖的解决方案。

考虑到KDIGO指南建议DKD患者每3个月检测一次mALB和肌酐水平，本研究提出的智能医疗模型旨在提高患者的便利性。利用光子晶体微阵列平台，患者可以在家中进行检测，并通过无线方式将结果实时传输给医疗提供者。这一流程使得检测结果能够迅速传递给临床团队进行详细评估和及时反馈，从而实现即时检测、远程诊断和分级医疗护理的整合，为更高效和精确的医疗服务体系做出贡献。

本研究采用了一系列材料和方法来构建和优化光子晶体微阵列。所有化学品均为分析级，并直接从容器中使用，无需额外纯化。所用材料包括N-(3-(二甲氨基)丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基磺酸琥珀酰亚胺钠盐（sulfo-NHS）、乙二醇、高灵敏度阻断溶液、酪蛋白钠盐（CSS）等。此外，乙二醇和BYK-3400由Sinopharm化学试剂公司提供。牛血清白蛋白（BSA）和磷酸盐缓冲液（PBS）由北京Solarbio科技公司提供。ALB捕获抗体和检测抗体由Medix Biochemica公司提供。超纯水由Milli-Q Plus 185水纯化系统制备，达到18.2 MΩ·cm的电阻率。Cy5标记的检测抗体由北京生物科学技术公司提供。SonoPlot Microplotter II用于制作光子晶体微阵列。光子晶体的反射光谱通过角分辨光谱仪（HR4000CG-UV-NIR，Ocean Optics公司）进行分析。表面形貌通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察，使用JEOL-SU8020显微镜（东京，日本）。荧光成像使用Nikon C2共聚焦激光扫描显微镜完成，而完整的微阵列图像则通过Canon 60D数码相机记录。

光子晶体微阵列的制作采用了常温条件下的高精度Nordson PICO Pulse流体喷射打印技术，包括XP和PROPlus4系列型号。首先，在PET基底上直接打印直径为600 μm的微阵列，形成包含290 nm PS微球的光子晶体结构。打印过程中形成的液滴体积约为400皮升。打印完成后，微阵列在室温下自然干燥，随后在110°C下进行25分钟的热处理，以进一步固化结构，确保其与PET基底的强附着性，并防止在接触水性溶液时微结构溶解，从而保持检测单元的完整性。为了激活羧基基团，制备了包含EDC（40 mg/mL）和sulfo-NHS（40 mg/mL）的激活溶液，并将其滴加到微阵列表面，进行10分钟的孵育后，再用去离子水进行三次清洗并干燥。接着，将70 μg/mL的ALB捕获抗体溶液滴加到微阵列表面，并在室温下孵育2小时，之后再次清洗并干燥。为减少非特异性吸附，微阵列表面的羧基基团被0.005%的交联溶液（CSS）和1%的BSA溶液处理，持续10分钟。处理完成后，微阵列再次用去离子水清洗三次并干燥。制造完成后，微阵列被保存在4°C的冰箱中。整个打印过程均在常温下进行。

在光子晶体微阵列的构建过程中，微球的尺寸对荧光增强效果至关重要。实验结果表明，290 nm的PS微球在荧光增强方面表现最佳，因此被选为后续研究的材料。在微阵列的表面处理过程中，通过化学偶联形成了稳定的酰胺键（-CONH），从而将抗体牢固地固定在微阵列上。此外，为了减少非特异性吸附，微阵列表面被一种包含BSA、酪蛋白和专有高效阻断剂的阻断溶液覆盖。这种抗污染层能够封闭未反应的结合位点，降低背景噪声并提高检测灵敏度。在检测过程中，只需将10 μL的尿液样本与Cy5标记的检测抗体混合后滴加到微阵列上，即可在10分钟内完成检测。这一过程不仅快速，而且操作简便，非常适合临床应用。

为了确保实验结果的可重复性和准确性，本研究使用了ELISA试剂盒进行对比验证。标准曲线和95%置信区间及预测带展示了荧光强度与尿液白蛋白浓度之间的相关性。光子晶体微阵列的检测范围为19.5至10,000 pg/mL，其R2值为0.9877。这一范围涵盖了微白蛋白尿的临床相关阈值（20-200 mg/L），且实验结果与该诊断范围一致。此外，检测时间根据Chi等人的基础研究进行了优化，以确保在10分钟内完成检测。这一时间效率显著优于传统的ELISA试剂盒，后者通常需要2-3小时的检测时间。

在尿液样本的一致性评估中，研究团队使用了光子晶体微阵列和ELISA试剂盒对mALB水平进行了比较分析。结果显示，光子晶体微阵列在检测尿液样本时与标准ELISA试剂盒表现一致，且检测准确率达到92.9%。Bland-Altman分析进一步验证了两种方法之间的协议一致性。黑色虚线表示两种方法之间的平均差异为-0.8109，接近零的值表明系统偏差较小。红色虚线表示95%的协议范围，从13.43到11.80，这些范围由平均差异±1.96倍差异的标准差计算得出，涵盖了约95%的数据点，反映了差异的分布范围。大多数数据点随机分布在平均差异线上，并且位于95%协议范围内，表明两种方法之间的差异没有明显模式，符合随机误差，说明良好的一致性。此外，两种方法之间的相关系数为0.9789（P < 0.0001），表明存在强烈的线性关系。

光子晶体微阵列在临床应用中的优势不仅体现在其快速检测能力上，还在于其灵敏度和特异性。通过将捕获抗体和检测抗体的浓度优化为70 μg/mL和6.75 μg/mL，研究团队实现了最大化的荧光信号差异，并确保了最佳的检测灵敏度和动态范围。此外，该微阵列在检测过程中表现出良好的稳定性，即使在使用去离子水或1× PBST进行清洗后，抗原-抗体结合仍然保持稳定。这表明该平台在处理复杂生物样本（如唾液、血清、全血和滑膜液）时具有良好的适用性。同时，该平台的检测时间显著缩短，且操作简便，非常适合家庭和社区医疗环境中的应用。

在实际临床应用中，光子晶体微阵列被用于量化DKD患者和健康对照组的mALB浓度。同时，血清肌酐（SCr）水平也在两个组别中进行了比较分析。结果显示，DKD患者的mALB水平显著高于健康对照组（DKD：41.31 [28.42, 93.66] ng/mL vs HC：7.28 [5.74, 12.30] ng/mL；P < 0.01），这表明mALB水平与DKD的严重程度密切相关。较高的mALB水平可能反映DKD患者更高的疾病进展风险和更严重的肾小球损伤。因此，早期检测和及时干预对于减缓疾病进展至关重要。

快速检测mALB在临床中具有重要意义。通过连续监测mALB浓度，可以准确评估DKD的进展情况，为临床医生调整治疗策略和优化患者预后提供有价值的参考。此外，这种便捷的POCT平台支持临床环境中的实时DKD监测，使患者能够在家中进行自我监测和评估，从而提高患者的参与度和疾病管理能力。这一创新不仅有助于提升医疗效率，还为患者提供了更自主的健康管理方式。

未来，研究团队计划构建一个以DKD诊断为核心的智能医疗生态系统，利用光子晶体微阵列技术实现更广泛的临床应用。同时，他们还打算开发一种基于智能手机的检测平台，能够将实时检测数据传输到医疗机构，从而实现POCT、远程诊断和分级医疗服务的无缝整合。这些进步将显著改善老年DKD患者的疾病管理，使早期诊断和长期疾病监测成为可能，最终提升患者的生活质量，改善临床结果，并降低医疗成本。通过大规模生产，每个检测的成本有望大幅降低，从而推动该技术在更广泛临床环境中的应用。