基于FRET的高通量筛选方法用于发现结核分枝杆菌DNA ADP-核糖基糖水解酶DarG的抑制剂

《ACS Infectious Diseases》：A FRET-Based High-Throughput Screening Assay for the Discovery of Mycobacterium tuberculosis DNA ADP-Ribosylglycohydrolase DarG Inhibitors

DarTG2系统通过DarT2毒素和DarG抗毒素调节细菌生存及抗噬菌体反应，其中DarG的 macrodomain负责逆转ADP-核糖修饰。本研究开发FRET结合测试筛选出pranlukast，该化合物特异性抑制结核分枝杆菌及近缘细菌的DarG活性，但对人类macrodomain无影响，为抗结核药物开发提供新靶点。

　　

DarTG2是一种保守的毒素-抗毒素ADP-核糖化系统，它调控着许多致病细菌（包括结核分枝杆菌）的生存能力和抗噬菌体反应。DNA ADP-核糖转移酶（DarT2）通过单ADP-核糖化作用于特定的DNA序列基序，可能导致细菌进入休眠状态；而DNA ADP-核糖水解酶（DarG）这种抗毒素则含有高度保守的宏观结构域，能够逆转这种修饰并恢复细菌的生长。因此，开发针对DarG的选择性抑制剂可能成为对抗结核病的一种有前景的策略。然而，目前尚未发现任何能够靶向DarG的小分子抑制剂。在这里，我们开发并优化了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的简单而可靠的结合测定方法，用于识别能够与DarG宏观结构域结合的小分子抑制剂。该测定方法利用荧光融合蛋白来检测DarG宏观结构域与ADP-核糖化肽之间的相互作用。通过这种方法对目标导向的表型文库进行筛选，我们发现了pranlukast，它能够选择性地抑制结核分枝杆菌以及其细菌同源物（如嗜热菌中的DarG和紫色链霉菌中的SCO6735）的DNA ADP-核糖水解酶活性。值得注意的是，pranlukast并未抑制人类体内的宏观结构域，表明其对细菌靶点具有很强的选择性。由于此前已有研究表明pranlukast能够减轻结核分枝杆菌的感染负担，进一步研究其在这一领域的作用机制将具有价值。