源自Affibody的药物偶联物能够靶向表皮生长因子受体，是一种高效且特异的细胞毒性剂

《ACS Pharmacology & Translational Science》：Affibody-Derived Drug Conjugates Targeting The Epidermal Growth Factor Receptor Are Potent And Specific Cytotoxic Agents

本研究设计并表征了一种新型EGFR靶向药物偶联物Z_EGFR-ABD-mcDM1，由EGFR结合affibody、白蛋白结合域及细胞毒性药物mcDM1组成。体外实验显示其对EGFR高表达的A431细胞具有高选择性杀伤（IC50=3.4 nM），且结合特异性经SPR验证。体内实验表明其肿瘤靶向性显著优于阴性对照组，并通过ABD延长半衰期并减少肝脏摄取。该偶联物为克服EGFR靶向药物耐药性问题提供了新策略。

　　EGFR，即表皮生长因子受体，是多种癌症治疗中的重要靶点。其在多种肿瘤细胞中过度表达，如非小细胞肺癌（NSCLC）、胶质母细胞瘤（GBM）、乳腺癌（BC）、结直肠癌（CRC）和头颈鳞状细胞癌（HNSCC）等。EGFR的异常激活不仅促进了细胞增殖，还抑制了细胞凋亡，因此，开发针对EGFR的靶向药物具有重要意义。然而，尽管现有的EGFR靶向药物在临床中取得了一定成效，大多数患者在治疗过程中仍会发展出耐药性，这限制了它们的长期疗效。因此，探索新的EGFR靶向治疗策略成为研究的重点。

本研究设计并表征了一种新型的EGFR靶向药物偶联物，即所谓的AffiDC（Affibody-based Drug Conjugate）。该偶联物由一个能够特异性结合EGFR的Affibody分子Z_EGFR与一个能够延长半衰期的白蛋白结合域（ABD）融合而成，并通过一个非裂解型的maleimidocaproyl（mc）连接子偶联上高度细胞毒性的药物DM1。这种药物偶联物在体外显示出对EGFR表达细胞的强结合能力，并且在对A431细胞的实验中表现出高杀伤力，其IC₅₀值仅为3.4 nM。在动物模型中，该药物偶联物在EGFR高表达的A431异种移植瘤中表现出适度的摄取，表明其具有良好的靶向性。此外，该药物偶联物在实验中表现出的特性使其成为一种具有潜在应用价值的新型抗癌药物。

Affibody分子是一类源自金黄色葡萄球菌蛋白A的折叠肽，仅由58个氨基酸组成。与传统的单克隆抗体相比，Affibody分子具有更小的体积，这使得它们能够更好地穿透肿瘤组织，从而提高药物递送效率。然而，Affibody分子在体循环中会被快速清除，因此通过将其与白蛋白结合域融合，可以显著延长其半衰期。白蛋白结合域（ABD）与白蛋白的结合能力使其在体循环中能够避免被肾脏过滤，同时还能通过与FcRn（新生儿Fc受体）的相互作用减少被溶酶体降解的风险。此外，为了方便追踪药物在体内的分布情况，该药物偶联物在N端添加了一个His-Glu-His-Glu-His-Glu（HE₃）标签，用于放射性标记。

在药物偶联物的制备过程中，研究人员首先将Z_EGFR和ABD基因进行融合，通过大肠杆菌表达系统生产出目标蛋白。随后，使用还原剂将蛋白中的半胱氨酸残基还原，以便与mcDM1偶联。通过一系列纯化步骤，包括尺寸排阻色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC），研究人员获得了高纯度的药物偶联物。同时，为了评估药物偶联物的稳定性，还进行了放射性标记实验，并通过不同的条件测试了其在体外的稳定性。

药物偶联物的结合特异性、内化和细胞保留能力通过放射性标记和细胞实验进行分析。实验结果显示，药物偶联物能够特异性地结合EGFR表达的细胞，并且其结合能力可以被cetuximab阻断，这进一步证实了其对EGFR的高度特异性。此外，药物偶联物在不同EGFR表达水平的细胞中表现出不同的内化速率，其中A431细胞（EGFR高表达）表现出更快的内化速度，而PC-3细胞（EGFR低表达）则较慢。这些结果表明，药物偶联物的内化效率与靶点的表达水平密切相关。

在体内的分布实验中，研究人员将药物偶联物注射到携带EGFR阳性A431异种移植瘤的小鼠体内，并在4小时和24小时后测定其在不同器官中的摄取情况。结果显示，药物偶联物在肿瘤中的摄取量在4小时和24小时之间略有增加，而在肝脏和肾脏中的摄取量显著下降。这表明，药物偶联物在体内具有一定的靶向性，且其半衰期延长的特性有助于提高药物在肿瘤组织中的积累。相比之下，EGFR阴性RAMOS异种移植瘤中的药物摄取量明显低于EGFR阳性A431瘤，进一步验证了药物偶联物的靶向性。

此外，研究人员还评估了药物偶联物的体外细胞毒性。实验结果表明，Z_EGFR-ABD-mcDM1对EGFR高表达的A431细胞表现出显著的杀伤作用，而对EGFR低表达的MCF-7细胞则无明显影响。这一特性表明，该药物偶联物的细胞毒性主要依赖于EGFR的表达水平，且其在高表达细胞中具有更强的杀伤能力。同时，研究还发现，即使在EGFR表达水平相似的细胞系中，不同细胞系对药物偶联物的敏感性也存在差异，这可能与细胞内的转运机制、溶酶体降解能力以及多药耐药蛋白的表达水平等因素有关。

为了进一步优化药物偶联物的特性，研究人员还探讨了使用不同的连接子和药物载荷对药物性能的影响。例如，通过添加Glutamic酸序列（E3）在C端，可以有效减少药物在肝脏的非特异性摄取。这一发现对于减少肝脏毒性、提高药物在肿瘤组织中的靶向性具有重要意义。此外，药物偶联物的稳定性测试表明，其在体外的放射性标记非常稳定，且在不同温度条件下释放率较低，显示出良好的药物保留能力。

本研究的成果表明，Z_EGFR-ABD-mcDM1是一种具有高靶向性和强细胞毒性的新型EGFR靶向药物偶联物。它不仅能够有效结合EGFR表达的细胞，还能通过延长半衰期提高药物在体内的生物利用度。同时，其在体内的分布特性表明，药物能够有效地靶向肿瘤组织，而对正常组织的摄取较少，从而降低潜在的副作用。这些特性使得该药物偶联物在未来的临床开发中具有广阔的前景。

综上所述，本研究通过设计和表征一种基于Affibody的EGFR靶向药物偶联物，为克服现有EGFR靶向药物的耐药性和毒性问题提供了新的思路。该药物偶联物不仅具有良好的靶向性，而且在体外和体内实验中均表现出显著的细胞毒性，显示出其在抗癌治疗中的潜力。未来的研究可以进一步探讨该药物偶联物在不同的肿瘤模型中的疗效，并评估其在临床试验中的安全性与有效性。