基于与（AND）逻辑门的双特异性DNA电路，用于等温条件下检测HBV rcDNA

《JACS Au》：AND Logic Gate-Based Dual-Specificity DNA Circuit for Isothermal HBV rcDNA Detection

定量分析血液中HBV DNA对控制病毒传播和改善预后至关重要，但HBV基因组复杂易变，包括多位点耐药突变、相邻突变位点和密码子简并性导致的氨基酸突变保守问题，现有检测技术存在特异性不足、设备昂贵或灵敏度低等缺陷。本研究提出基于AND逻辑门的双特异性DNA电路（DSDC）检测策略，通过设计同时包含识别元件和信号放大元件的探针，结合toehold介导的DNA链置换（TMSD）和RNase H切割机制，实现高灵敏度（检测限29.11 fM）和优异的相邻突变位点特异性识别。实验验证了该方法在血清样本中的可靠性和临床适用性，可区分entecavir耐药相关多突变位点（如rtL180M与rtT184G），为便携式HBV检测提供创新解决方案。

　　HBV（乙型肝炎病毒）作为一种重要的传染病病原体，其感染和传播对全球公共卫生构成了严重威胁。随着医学研究的不断深入，针对HBV的诊断与治疗技术也在持续发展。然而，HBV基因组的复杂性给检测工作带来了诸多挑战。HBV基因组不仅具有高度的变异特性，还存在多种突变形式，如与抗病毒药物如恩替卡韦（entecavir）相关的多点突变，以及在基因序列上相邻的突变位点。此外，由于遗传密码的简并性和氨基酸突变的保守性，区分错义突变和无义突变变得尤为重要。这些因素使得传统的检测方法在灵敏度、特异性以及突变识别方面存在局限，亟需一种更加高效、准确且适用于临床场景的检测手段。

为应对上述挑战，本研究提出了一种基于AND逻辑门的双特异性DNA电路检测策略。该方法通过整合RNA酶H切割与toehold介导的DNA链置换反应，实现了对HBV DNA的高灵敏度和高特异性检测。DNA电路的引入不仅提高了信号放大能力，还增强了检测系统的稳定性，使得在等温条件下即可完成对HBV DNA的识别与定量分析。同时，该策略具备良好的突变识别能力，特别是在区分相邻单碱基错配方面表现出色，为临床诊断提供了新的技术支持。

HBV DNA在血液中主要以松弛环状DNA（rcDNA）的形式存在，这种结构在检测过程中具有独特优势。rcDNA由一条完整的负链和一条较短的正链组成，负链中存在一个单链缺口区域。这一结构特性使得无需高温变性即可进行检测，为开发等温检测技术提供了可能。然而，HBV基因组的变异特性，如多点突变、相邻突变位点以及错义与无义突变的区分需求，对现有检测技术提出了更高的要求。传统的qRT-PCR技术虽然在临床中广泛应用，但其依赖精确的温度控制和昂贵的设备，难以满足快速、简便、高灵敏度和高特异性的检测需求。此外，一些等温扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP）、链置换扩增（SDA）和滚环扩增（RCA），虽然具有操作简便和成本低的优点，但在检测特异性方面仍显不足，难以应对HBV基因组的复杂性。

针对这些挑战，本研究设计了一种包含识别元件和扩增元件的双特异性DNA探针。该探针通过AND逻辑门机制，确保只有当目标DNA同时满足两个元件的特异性条件时，才能触发荧光信号的循环放大。识别元件通过toehold介导的DNA链置换反应实现，利用DNA链的动态置换特性，对目标DNA进行特异性识别。而扩增元件则依赖于RNA酶H对DNA-RNA异源双链的特异性切割，确保只有匹配的目标DNA才能有效引发信号放大。这种双机制的结合，使得检测系统能够在保持高特异性的同时，实现对目标DNA的高效识别和信号放大。

在实验过程中，研究人员通过一系列优化实验，验证了该方法的可行性。首先，通过调整探针R的长度，确定了最佳的信号与噪声比（SNR），从而提高了检测的灵敏度。随后，通过引入燃料探针F，进一步增强了信号放大效果。在检测过程中，当目标DNA存在时，能够有效替代探针R，形成可被RNA酶H切割的DNA-RNA异源双链，从而释放荧光信号。同时，燃料探针F还能促进目标DNA的循环利用，使得检测过程能够在等温条件下持续进行，显著提高了检测效率。

为了评估该方法的特异性，研究人员设计了一系列单碱基错配的实验。结果显示，当目标DNA在识别元件或扩增元件处发生单碱基错配时，荧光信号的强度显著降低，表明该方法能够有效区分错义与无义突变。特别是在处理相邻突变位点时，该策略展现出卓越的识别能力。例如，针对恩替卡韦耐药相关的rtL180M、rtT184G、rtS202G和rtM204V等突变位点，研究人员验证了该方法能够同时识别多个相邻突变，从而为临床诊断提供了更加精准的工具。

此外，研究人员还通过临床样本验证了该方法的实际应用价值。实验结果显示，该方法在健康人血清样本中的检测结果与标准缓冲液中的检测结果非常接近，且在不同浓度的HBV DNA样本中均表现出良好的线性关系和回收率。这表明该方法不仅适用于实验室环境，还具备在实际临床环境中应用的潜力。通过比较该方法与qRT-PCR的检测结果，发现两者在定量分析上具有高度一致性，进一步证明了该方法的可靠性与准确性。

在检测过程中，研究人员采用了一种等温反应体系，使得整个检测过程能够在恒定温度下进行，避免了传统高温扩增方法对设备和操作条件的依赖。这种等温特性不仅提高了检测的便捷性，还降低了实验成本，为实现便携式、即时检测（POCT）提供了技术支持。同时，该方法还具备良好的稳定性和适应性，能够适用于不同来源的样本，如血液样本等，为HBV感染的早期诊断和治疗监测提供了新的解决方案。

该研究的创新点在于将AND逻辑门机制与DNA电路相结合，从而构建了一种具有双重特异性的检测平台。通过这种设计，研究人员成功实现了对HBV DNA的高灵敏度检测，同时具备了识别相邻单碱基错配的能力。这一技术突破不仅提升了检测的准确性，还为HBV耐药突变的早期识别提供了重要手段。此外，该方法的简便操作和等温特性，使其在临床场景中具有广泛的应用前景，特别是在资源有限的地区或现场快速检测中，能够发挥重要作用。

综上所述，基于AND逻辑门的双特异性DNA电路检测策略为HBV DNA检测提供了一种全新的方法。该方法通过结合RNA酶H切割与toehold介导的DNA链置换反应，实现了对目标DNA的高效识别和信号放大。其在灵敏度、特异性以及突变识别方面均表现出色，尤其适用于处理HBV基因组的复杂变异情况。同时，该方法具备良好的稳定性与适应性，能够在不同实验条件下保持一致的检测效果。此外，其等温操作特性使得检测过程更加便捷，为实现即时检测（POCT）提供了有力支持。随着技术的进一步发展，该方法有望在临床诊断、治疗监测以及病毒防控等方面发挥更大的作用，为全球公共卫生事业做出积极贡献。