NRVS光谱技术解析了[NiFe]氢化酶中的不同桥联氢化物中间体

《Journal of the American Chemical Society》：NRVS Spectroscopy Resolves Distinct Bridging Hydride Intermediates in [NiFe]-Hydrogenase

氢化酶活性位点铁-氢键振动特征研究：使用57Fe标记和同步辐射核共振振动光谱（NRVS）技术，首次解析了[NiFe]-氢化酶所有催化中间体的Fe-配体振动模式，发现结构刚性保持，同时Fe-H键存在细微差异（Ni-a-SR与Ni-a-C键长分别为1.79 ?和1.76 ?），影响催化效率。

　　本研究通过一种创新的生物化学方法，成功实现了对[NiFe]-氢酶活性中心铁原子的特异性标记，利用同步辐射基于的核共振振动光谱（NRVS）技术，对氢酶催化过程中的所有中间体进行了全面的振动模式分析。这一突破性进展不仅揭示了[NiFe]-氢酶在催化氢气分解或合成过程中涉及的复杂结构变化，还为理解其高效的电子与质子传递机制提供了新的视角。活性中心铁的标记使研究人员能够更精确地捕捉到与催化活性直接相关的振动信号，从而推动了对氢酶反应机理的深入研究。

[NiFe]-氢酶是一种多亚基金属酶，其最小的催化单元由大亚基和小亚基组成，负责氢气的裂解或生成。催化过程发生在异双金属NiFe(CN)?CO生物无机辅因子上，该辅因子通过四个半胱氨酸残基与大亚基共价结合。小亚基则包含铁硫簇，用于电子传递至红ox伴侣。同时，质子的转移依赖于特定的质子通道。氢气转化过程中涉及一系列活性中心的中间体，尽管已有多个研究小组对此进行了探讨，但其确切数量和结构仍然存在争议。因此，开发更精确的光谱方法对于揭示这些中间体的结构特性至关重要。

在本研究中，研究人员采用了一种新的方法，能够在体外组装一个功能完整的CnRH（来自Cupriavidus necator的[NiFe]-氢酶），并实现了对活性中心铁的高选择性标记。这种标记方法使得NRVS数据中与Fe–CO/CN振动相关的信号显著增强，特别是在400–620 cm?1的频率范围内。此外，该方法还成功用于记录H?结合的Ni?-S中间体的NRVS数据。通过对这些数据的分析，研究人员发现了两种不同的金属-氢桥接振动模式，分别对应于Ni?-SR和Ni?-C中间体。这些振动信号的分离表明了活性中心铁-氢键的不同性质，反映了催化过程中不同的化学环境和键合特征。

值得注意的是，这两种金属-氢桥接振动模式之间存在较大的能量间隔（Δν ≈ 34 cm?1），这可能是由于它们在催化过程中所处的结构环境不同。例如，Ni?-SR中间体的Fe–H键可能相对较弱，导致其振动频率较低。而Ni?-C中间体的Fe–H键则更为紧密，这可能与其较高的电子密度有关。通过对这些振动信号的进一步分析，研究人员能够估算出Ni?-SR和Ni?-C中间体的Fe–H键长，分别为约1.79 ?和1.76 ?。这种微小但显著的键长变化，表明活性中心在不同催化状态下的结构动态性，可能对催化效率和反应速率产生重要影响。

此外，研究还发现，在H?/H?O处理的样品中，存在一个与Ni?-C中间体相关的H/D敏感振动信号，该信号在D?/D?O处理的样品中消失，这进一步支持了该信号与氢桥接振动的关联。通过在低温下进行光解实验，研究人员确认了Ni?-C和Ni?-SR中间体在光照下可以转化为Ni?-L2中间体，这一过程伴随着活性中心氢桥接振动的消失和Ni?物种的形成。这些实验结果不仅验证了中间体的结构特性，还揭示了氢桥接在催化过程中的动态行为。

研究还比较了不同催化状态下的振动信号，发现尽管中间体结构存在差异，但活性中心的Fe–CO/CN振动区域表现出高度的结构一致性，这表明活性中心在催化过程中保持了相对稳定的构型。同时，低频区域的振动模式则显示出一定的变化，主要源于[Fe–Ni]中心的内旋振动以及辅因子相对于蛋白质骨架的位移。这些低频振动信号可能反映了活性中心内部的动态行为，如配体的运动或辅因子的相对位移，而这些变化在催化过程中可能对反应路径和效率产生关键作用。

通过对不同催化状态的振动信号进行对比分析，研究人员发现，尽管活性中心在结构上保持了高度的刚性，但在某些局部区域仍存在细微的变化。这些变化可能与蛋白质骨架中侧链或氢键的重新定向有关，而非活性中心整体结构的重大调整。这表明，活性中心的结构稳定性对于高效的电子和质子传递至关重要，而细微的结构变化则可能影响其催化性能。因此，活性中心的刚性与氢桥接的动态特性可能是[NiFe]-氢酶高效催化的重要基础。

本研究的结果与近期由Ash、Vincent等人的晶体学研究结果相吻合，后者发现E. coli来源的Hyd-1氢酶在催化循环过程中，其主配位球结构变化非常有限。这进一步支持了[NiFe]-氢酶活性中心在催化过程中保持结构稳定性的观点。研究还强调了结构刚性与氢桥接动态性的结合对于催化效率的重要性，这为未来设计更高效的生物模拟[NiFe]复合物提供了理论依据。

综上所述，本研究通过创新的标记方法和先进的光谱技术，成功揭示了[NiFe]-氢酶活性中心在不同催化状态下的结构特征。这一成果不仅深化了我们对氢酶催化机制的理解，还为开发新型的生物模拟催化剂提供了重要的结构参考。未来的研究可以进一步探索这些结构特征在不同环境条件下的变化，以及它们如何影响催化活性和反应速率。此外，结合其他光谱技术，如红外光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱，可以更全面地揭示氢酶的反应机制，为相关领域的研究提供更丰富的数据支持。