采用深度共晶溶剂辅助的基质固相分散萃取法测定色素小麦中的酚类化合物

《Journal of Chromatography Open》：Use of a deep eutectic solvent-assisted matrix solid-phase dispersion extraction for phenolic compounds determination from pigmented wheat

本研究开发了一种基于深共熔溶剂（DES）的基质固相分散（MSPD）提取方法，用于高效提取紫小麦中的酚类化合物。通过Box-Behnken设计优化，确定最佳条件为1:3样品-分散剂比例、87.65 μL DES体积、1.42 mL提取溶剂体积和1次循环，总酚含量达3.562 mg GAE/g。该方法相比传统超声辅助提取（UAE）效率更高，且通过AGREEprep等指标验证了其环境可持续性。HPLC-PDA分析鉴定出多酚酸、黄酮类等化合物。

　　### 一种用于提取色素小麦中酚类化合物的绿色方法开发与优化

在本研究中，开发并优化了一种创新的提取方法，用于从色素小麦中确定酚类化合物的含量。该方法采用了一种称为深共熔溶剂（DESs）的新型溶剂体系，以提供一种比传统有机溶剂提取更环保的替代方案。通过将DES加入到矩阵固相分散（MSPD）提取过程中的均质化步骤，实现了更高的提取效率，同时减少了有机溶剂的使用量和对环境的影响。研究还发现，基于胆碱氯化物和甘油（1:2摩尔比）的DES表现出最佳的提取效果。通过使用三水平四因素的Box-Behnken设计（BBD）对提取过程进行了优化，评估了样本与分散材料的比例、DES体积、提取溶剂体积以及提取循环次数等因素。在最佳条件下，总酚类化合物含量（TPC）达到了3.562 ± 0.005 mg GAE/g。AGREEprep、BAGI和ComplexMoGAPI指标确认了该方法的环境可持续性。通过高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-PDA）确定了提取的酚类化合物的定性分析。

### 研究背景

小麦作为全球最重要的农作物之一，是超过三分之一人口日常饮食的重要组成部分。除了提供主要的营养成分如碳水化合物和蛋白质外，小麦还富含多种生物活性化合物，如黄酮类、类胡萝卜素、酚酸和花青素。色素小麦因其外层（颖壳）呈现出从紫色到蓝色再到深红色的多种颜色而显得独特。这种颜色主要归因于花青素的存在。此外，色素小麦还含有其他类型的生物活性分子，如酚酸和类胡萝卜素。通常情况下，这些物质在传统小麦中的含量较低。生物活性分子在小麦中的分布情况是多样的，从外层到内层逐渐减少；同时，不同小麦部位的植物化学成分种类也有所不同。

生物活性化合物不仅具有正常的营养特性，还对人类健康有积极影响。由于其较高的抗氧化能力，这种小麦在减少氧化应激和慢性疾病风险方面具有重要作用。因此，近年来消费者对基于谷物的产品表现出浓厚的兴趣。因此，有必要深入研究和实验活动，以提高小麦颖壳中营养物质的含量。酚酸是有机化合物，属于多酚家族。根据其结构，它们被分为两类：苯甲酸和肉桂酸。此外，酚酸还可以分为游离和结合型，但结合型酚酸的抗氧化能力更为显著。

在色素小麦中，最丰富的酚酸是香草酸，它构成了紫色色素小麦的主要抗氧化成分。其他重要的生物活性化合物包括没食子酸、对香豆酸、槲皮素、儿茶素和香兰酸。传统白小麦面粉在精制过程中去除了麸皮，因此不含酚类化合物。色素小麦的种类和颜色受多种环境和遗传因素的影响，如光照、温度、土壤质量和水分胁迫等。小麦的遗传学背景较为复杂，涉及多个基因在花青素生物合成途径中的作用。近年来，研究者已经识别出关键的调控基因，如MYB和bHLH转录因子，这些基因调节小麦颖壳中花青素生成酶的表达。

### 材料与方法

在实验过程中，使用了多种溶剂和试剂，包括乙腈（ACN；≥99.9%）、甲醇（MeOH；≥99.9%）、乙醇（EtOH；≥99.8%）、己烷（≥99.8%）、HPLC-MS级水、甲酸（≥95%）和Florisil?，这些均来自Sigma-Aldrich（米兰，意大利）。此外，还购买了没食子酸、香草酸、槲皮素、儿茶素、原儿茶酸和香兰酸的标准品，用于HPLC-PDA分析。所有标准粉末均使用分析天平（Mettler Toledo MS105DU）进行称量，并在MeOH中制备1 mg/mL的储备液。所有溶液均储存在-80°C。

在DES的制备过程中，使用了胆碱氯化物（ChCl）、甘油（Gly）和乙二醇（EG）作为原料，这些原料均来自Carlo Erba（米兰，意大利）。此外，用于Folin-Ciocalteu测试的化学试剂，包括没食子酸（97.5%）、碳酸钠（>99.5%）和Folin-Ciocalteu试剂，也来自Sigma-Aldrich（米兰，意大利）。

### 实验设计与数据分析

为了优化提取过程，首先对溶剂类型和提取技术进行了评估。TPC被选为响应参数。在优化过程中，进行了单因素优化（OFAT），以确定最佳的提取溶剂。随后，通过MSPD提取技术进一步提高提取效率。MSPD利用样品与分散固相（如硅胶或Florisil?）之间的相互作用，提高目标化合物的可提取性。在均质化阶段，加入DES可以显著提高提取效率。

为了确定最佳的DES类型，研究者测试了三种不同的DES：ChCl-Gly、ChCl-EG和Bet-Gly，所有DES均采用1:2的摩尔比。通过实验评估，发现ChCl-Gly在提高TPC方面表现最佳。这是因为DES可以通过氢键与酚类化合物（如羟基苯甲酸和黄酮类化合物）相互作用，从而提高其提取效率。

为了进一步优化提取条件，研究者使用了三水平四因素的Box-Behnken设计（BBD），评估了样本与分散材料的比例、DES体积、提取溶剂体积和提取循环次数等因素。实验结果表明，这些因素对提取效率有显著影响，尤其是样本与分散材料的比例、DES体积和提取循环次数。通过计算R2和R2adj，研究者评估了模型的效率。最终，实验确定了最佳的提取条件，包括1:3的样本与分散材料比例、87.65 μL的DES体积、1.42 mL的提取溶剂体积和1次提取循环。

### 酚类化合物的定性分析

为了确定提取的酚类化合物的定性分析，研究者使用了HPLC-PDA分析。分析过程使用了Ascentis? C18色谱柱，流速为1 mL/min，流动相为水和乙腈的混合物。通过比较标准品的保留时间和文献数据，确定了提取物中的酚类化合物种类。实验结果表明，提取物中包含没食子酸、原儿茶酸、槲皮素、儿茶素、槲皮素3-O-芸香苷和香草酸。

### 绿色性评估

为了评估优化方法的绿色性，研究者计算了AGREEprep、BAGI和ComplexMoGAPI的总体评分。AGREEprep评估了方法对绿色化学十大原则的遵守情况，包括原位样品处理、使用更安全的溶剂和试剂、使用可持续、可重复使用和可再生材料、减少废物和样品量、最大化生产力、整合步骤和促进自动化、减少能源消耗、选择最可持续的分析配置、实施安全的操作程序等。研究结果显示，AGREEprep评分为0.6，表明该方法在环境可持续性方面表现出色。

BAGI评估了分析方法的适用性，包括分析类型、同时分析的化合物数量、所需的分析技术和仪器、同时处理的样品数量、样品处理步骤、每小时可分析的样品数量、使用的试剂和材料类型、是否需要预浓缩、自动化程度和样品量等。研究结果显示，BAGI评分为77.5，表明该方法具有良好的适用性和可行性。

ComplexMoGAPI则评估了方法的可持续性和安全性，包括样品处理、储存、运输、分析方法的规模、使用的溶剂和试剂、是否需要额外处理、仪器的能耗、操作人员的健康和安全风险、废物的产生和处理、定量分析等。研究结果显示，ComplexMoGAPI评分为0.6，表明该方法在环境和安全方面表现良好。

### 与其他方法的比较

为了比较不同方法的提取效率和绿色性，研究者对不同基质（如苹果渣、Helichrysum arenarium L.和Triticum turgidum subsp. durum）进行了评估。结果表明，MSPD方法在多个基质中表现出较高的提取效率和较好的环境可持续性。例如，在苹果渣中，UAE方法提供了较高的TPC（21.96 ± 0.82 mg GAE/g），但MSPD方法在绿色性方面表现更优。在Helichrysum arenarium L.中，使用NADES辅助的MSPD方法提供了更高的TPC（38.34 ± 0.09 mg GAE/g）和更好的环境性能。在Triticum turgidum subsp. durum中，UAE方法提供了TPC为1.39 ± 0.04 mg GAE/g，而MSPD方法提供了更高的TPC（3.562 ± 0.005 mg GAE/g），并且在绿色性方面也表现出色。

### 结论

本研究开发了一种新的微型MSPD提取方法，用于从色素小麦中提取酚类化合物。该方法在均质化步骤中加入了DES，从而提高了提取效率并减少了有机溶剂的使用量。研究结果表明，ChCl-Gly基的DES在提高TPC方面表现最佳，这可以归因于甘油的复杂结构，其含有多个羟基，能够通过氢键与酚类化合物相互作用。此外，该方法在绿色性方面也表现出色，通过AGREEprep、BAGI和ComplexMoGAPI的评估，证明了其对绿色化学原则的遵守。因此，本研究代表了一种创新的、可持续的提取方法，符合绿色化学的要求。