通过分析完整的纳米载体，揭示了聚合物胶束在体内的稳定性

《Journal of Controlled Release》：In vivo stability of polymeric micelles revealed by analysis of intact nanocarriers

聚合物微团在循环中的稳定性可通过密度梯度超速离心结合近红外-II荧光探针实时监测，发现mPEG-PLA微团稳定超过16小时，主要受LDL/HDL捕获影响，揭示纳米载体与脂蛋白的相互作用机制。

　　

作者：张志晨、蔡一帆、韩荣泽、刘畅、何海生、卢毅、吴伟

复旦大学药学院，教育部智能药物递送重点实验室及国家先进药物制剂克服递送障碍重点实验室，中国上海201203

摘要

聚合物胶束（PMs）在体内的稳定性一直是一个长期存在的争议话题。本研究通过直接分析生物样本中的完整胶束纳米载体，重新探讨了这一关键问题。我们建立了一种密度梯度超速离心（DGUC）方法，能够直接从生物组织中分离出完整的PMs，并采用聚集诱导淬灭（ACQ）探针进行近红外-II（NIR-II）成像，从而实现实时监测和精确量化胶束的完整性。结果表明，mPEG??-PLA?? PMs在循环系统中的结构稳定性可维持超过16小时。重要的是，脂蛋白（尤其是低密度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL）被证实是通过捕获共聚物来破坏PMs稳定性的主要血清成分，而白蛋白的影响则微乎其微。这一相互作用通过琼脂糖凝胶电泳和表面等离子体共振得到了验证，显示脂蛋白与PM聚合物之间存在纳米摩尔级别的亲和力结合。系统循环过程中PM密度的随时间增加表明胶束结构内部发生了内源性成分的交换。我们结合DGUC分离和基于ACQ的跟踪方法，为PM纳米载体的体内命运提供了前所未有的见解，解释了它们在体内的长期循环现象，并阐明了脂蛋白驱动的胶束结构稳定化和随后解体的机制。这些发现解决了之前关于PM稳定性评估的争议，为胶束药物递送系统的临床转化提供了重要的实验支持。

引言

由于聚合物胶束（PMs）体积小、在体内循环时间长、制备和功能化易于实现，近年来成为药物递送载体的研究热点[[1], [2], [3], [4]]。尽管几种PM制剂（如紫杉醇PMs（Genexol-PM?）[5]）已成功实现临床转化，但整体转化率仍然较低，主要原因是对胶束纳米载体在体内的命运了解不足[[6], [7], [8]]。当浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，PMs会在水介质中自组装[[9], [10], [11]]。静脉注射后，这些动态结构面临稀释、高剪切力以及与蛋白质和脂质等内源性成分的相互作用[[12], [13], [14], [15]]，这引发了关于其在复杂生理环境中结构稳定性的关键问题[[16]]。监测胶束的完整性对于阐明药物释放机制[[17,18]]和理解载体的功能（如长时间循环或器官靶向[[19,20]]至关重要，这些因素最终决定了治疗效果和临床结果。

早期使用³H放射性标记的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）共聚物的研究表明，即使在低于CMC的浓度下，胶束也能在血液中长时间循环，并且在注射后24小时内仍保持显著的完整性[[9]]。后续研究采用了基于F?rster共振能量转移（FRET）的荧光标记方法，克服了放射性标记无法确认结构完整性的局限，利用其距离依赖性的信号切换来监测颗粒的结合和解离[[12],[21],[22],[23]]。然而，即使是采用相同的FRET方法，结果也存在显著差异：Sun等人报告注射后15分钟和1小时的胶束完整性分别为47%和11%[[12]]，而Zhang等人观察到血液中的胶束完整性为82%，其中24%的完整性得以维持[[22]]。这种不一致性突显了基于FRET的PM评估方法的不确定性。Langridge等人尝试将FRET与密度梯度超速离心结合使用，发现mPEG-PCL PMs在血清孵育后1小时内迅速解体[[24]]，但该研究缺乏体内验证和量化。

这些争议需要重新审视PM的稳定性。准确评估需要实时成像和完整PM的量化，然而基于FRET的方法存在信号衰减、重新光照干扰和量化挑战[[6,12,22,24,25]]。本研究采用了一种替代策略，即使用聚集诱导淬灭（ACQ）探针[[26], [27], [28], [29], [30]]，这种探针在分子分散于疏水性PM核心时发出强烈荧光，但释放到水环境中时会发生完全的π-π堆叠诱导淬灭[[26]]。这建立了荧光强度与颗粒质量之间的正相关关系，从而能够精确追踪PM的结合动态[[31]]。因此，基于ACQ的成像在识别和量化完整胶束方面具有优越性，同时比传统荧光染料减少了游离探针的干扰[[31], [32], [33], [34]]。

由于胶束体积小且与生物分子的组成相似，从生物介质中回收它们仍然具有挑战性[[35,36]]。尽管已经尝试了诸如凝胶过滤色谱（可追溯到1993年[[37]]）以及AF4和蔗糖超速离心等技术，但很少有方法能有效检测生物样本中的胶束稳定性[[17,24,38]]。我们采用了传统用于脂蛋白分离的密度梯度超速离心（DGUC）方法[[39,40]]来回收血清中的胶束。我们的综合方法包括：1）使用NIR-II ACQ荧光染料标记PMs以进行准确的生物介质量化；2）通过原位检测实现实时的体内稳定性评估；3）从生物样本中回收PMs以直接观察其完整性；4）分析成分与PM的相互作用。结果表明，模拟Genexol-PM?的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（mPEG-PLA）PMs在体内保持结构完整性，并能循环超过16小时。胶束的逐渐解体主要是通过与低密度脂蛋白（LDL）的相互作用引起的，这为PMs作为纳米载体的实用性提供了重要的实验支持。

材料

mPEG??-PLA??购自中国厦门的Sinopeg公司。溴化钾、苏丹黑B和碳酸氢铵购自中国上海的Aladdin公司。蛋白质G琼脂糖、Bradford蛋白测定试剂盒以及TAE（Tris、醋酸和EDTA）缓冲液（pH 8.0）购自中国上海的Beyotime公司。人血清白蛋白（HSA）和亚油酸双(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)钠盐（BS3）购自美国圣路易斯的Sigma–Aldrich公司。

基于ACQ的PMs标记

图1A展示了基于ACQ的荧光标记原理，用于监测PM的完整性。当ACQ荧光染料（ACQ1）被封装在完整PM的疏水性核心内时，其荧光会被激活。当PM解体时，释放出的探针分散到水环境中，在疏水性相互作用的作用下迅速聚集，导致荧光立即完全淬灭。这一机制建立了荧光强度与

结论

总之，我们成功建立了一种DGUC方法，可以从生物样本中分离并回收PMs，显著提高了我们对它们在体外和体内稳定性的理解。该方法的可靠性通过基于不同分离原理的琼脂糖凝胶电泳得到了相互验证。利用NIR-II区域的ACQ成像技术，实现了对颗粒完整性的直接观察和更精确的量化。我们的研究结果证明了PMs

CRediT作者贡献声明

张志晨：撰写原始草稿、方法学设计、实验研究、数据分析。蔡一帆：撰写原始草稿、方法学设计、实验研究、数据分析。韩荣泽：数据可视化、实验研究、数据分析。刘畅：方法学设计、数据分析。何海生：项目管理工作。卢毅：监督工作、资源协调、项目管理工作。吴伟：撰写与编辑、结果验证、监督工作、资源协调、项目管理工作、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号82030107和82273867）和上海市科学技术委员会（编号21430760800）的财政支持。