综述：体内纳米工程化T细胞用于CAR-T疗法

《Journal of Controlled Release》：In vivo nano-engineering T cells for CAR-T therapy

本综述系统阐述了体内T细胞纳米工程化这一前沿领域，重点探讨了从靶向递送到整合性设计框架的演进。文章深入剖析了病毒/非病毒载体（LNP等）的主动靶向设计（配体架构、亲和力、连接子化学）、脾脏趋向性等器官靶向策略，以及通过启动子（如CD2）、UTR设计、逻辑门电路等实现CAR表达的精准控制，旨在为开发可扩展、适应症定制化的体内CAR-T疗法提供 translational 指导。

　　

概述

在过去的十年中，以工程化T细胞为核心的细胞疗法在癌症治疗领域取得了显著进展。通过生物学、遗传学和材料科学等多种技术，T细胞的功能得到增强，使其能够识别特定的靶点或表位。病毒或非病毒载体促进了T细胞的基因工程改造，使其能够表达专门为靶向疾病部位治疗应用而设计的嵌合抗原受体（CAR）或转基因T细胞受体（TCR）。2017年，首批CAR-T疗法进入临床实践。截至2025年，已有七款CAR-T细胞产品获得美国FDA批准，适应症涵盖B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、大B细胞淋巴瘤/套细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病（LBCL/MCL/CLL）以及多发性骨髓瘤。值得注意的是，2025年6月，FDA取消了已批准CAR-T产品的风险评估与减灾策略（REMS）要求，标志着风险控制的成熟，但黑框警告仍然存在。

为了最大限度地减少过继性细胞疗法的副作用并改善患者预后，为每位患者量身定制的个性化治疗方案势在必行。然而，从患者或健康供体获取T细胞并进行复杂的基因工程操作，以及确保生产一致性，都面临着巨大挑战。当前制造过程耗时数周，成本高昂，因此，探索新的策略至关重要。

近年来，基因递送技术的突破彻底改变了我们指导和调控细胞功能的能力。病毒载体工程和替代性核酸递送方法（包括脂质纳米粒（LNP）和聚合物纳米粒（NP））显著拓宽了可实现基因组改变的范围。这些基因组递送系统为体内T细胞工程提供了基础平台，这是一种可以缩短制造过程、便于疾病进展患者快速获得治疗的通用策略。病毒或非病毒载体直接给予患者，对体内的循环T细胞进行编程；递送的核酸被核糖体翻译以产生展示在T细胞表面的CAR/TCR（非病毒mRNA为瞬时表达；病毒载体表达更持久）。这种方法有望克服体外T细胞工程面临的主要临床挑战，例如缺乏淋巴细胞清除化疗及其后续症状。此外，完整的免疫系统可能更有效地促进表位扩散并引发强大的抗肿瘤免疫反应。与体外制造并行，直接体内CAR工程已从啮齿类动物的概念验证迅速发展到转化研究。最近，Hunter等人的一项里程碑式研究报道了LNP介导在非人灵长类动物（NHP）体内生成功能性CAR-T细胞，并在肿瘤学和自身免疫模型中获得治疗益处——这牢固地确立了LNP作为原位T细胞编程的临床可信平台。

靶向纳米工程系统概述

靶向纳米递送系统的基本原理涉及三个相互依赖的过程：装载、靶向和释放。纳米递送系统的有效性取决于这些过程的优化整合。初始设计阶段涉及将治疗剂（如RNA、DNA、蛋白质或小分子药物）封装或缀合到纳米颗粒表面或其核心。根据纳米颗粒类型，装载可能通过物理包埋、化学缀合或自组装发生。随后，靶向机制引导装载的纳米颗粒到达特定的细胞、组织或器官。这可以通过被动靶向（如利用增强的渗透性和滞留（EPR）效应）或主动靶向（如使用配体-受体相互作用）来实现。最后，受控释放机制确保治疗剂在靶位点以预定速率和持续时间释放，从而最大化治疗效果同时最小化脱靶效应。

靶向递送的实施策略——主动靶向

纳米医学旨在增强系统性药物递送至特定部位，从而提高疗效并减少副作用。自从靶向癌症治疗的概念出现以来，增强的渗透性和滞留（EPR）效应在积累大分子或纳米颗粒（NP）于肿瘤中发挥了关键作用。虽然最初归因于肿瘤特异性血管异常（如渗漏血管和受损的淋巴引流），但EPR效应现在被认为具有高度的异质性和患者依赖性。主动靶向通过将特异性配体（如抗体、肽、适体）结合到纳米颗粒表面，利用靶细胞上过度表达的受体，提供了超越EPR效应的特异性。配体架构、亲和力（受配体密度和几何形状影响）以及连接子化学共同决定了受体结合、内吞作用和随后的细胞内运输。然而，可变EPR、脱靶效应和批次一致性等实际限制对主动靶向策略的设计提出了挑战。

器官水平靶向：脾脏作为关键部位

脾脏（最大的次级淋巴器官）为原位T细胞工程提供了一个实用的暴露平台，因为器官水平的沉积先于任何细胞水平的分割。其独特的微解剖结构和血流动力学（脾索/窦、富含巨噬细胞的边缘区以及过滤再循环环）为纳米颗粒的滞留和再分布设定了边界条件。在这个水平上，表观pK_a/电荷和界面化学控制着纳米颗粒与脾脏微环境的相互作用。与传统的肝脏导向系统不同，靶向脾脏的纳米载体作为一个新颖且尚未充分探索的治疗方向，为体内T细胞编程提供了选择性递送至淋巴驻留的T细胞前体的潜力，从而促进更精确的免疫调节。

控制体内免疫细胞工程的CAR表达水平

体内T细胞工程不仅仅是递送遗传物质，它要求对转基因表达进行精确的时空控制。与在受控条件下筛选和扩增基因修饰细胞的体外环境不同，体内表达发生在复杂、动态的生理环境中。这需要多层次的调控机制来平衡疗效与安全性。在转录水平，启动子如CD2、CD3或CD4提供了T细胞限制性表达谱，而诱导型或激活依赖性启动子（例如NFAT响应元件）可以将CAR表达与T细胞受体（TCR）信号传导偶联。在转录后水平，5‘和3’非翻译区（UTR）工程，包括引入微RNA（miRNA）结合位点用于去靶向（例如，在抗原呈递细胞中避免表达），可以进一步微调mRNA的稳定性和翻译效率。此外，蛋白质水平或基于合成生物学的逻辑门电路（例如，AND、NOT门）可以在不改变生物分布的情况下限制表达，从而实现更高的特异性。这些多层控制机制对于确保CAR-T细胞仅在遇到特定抗原组合时被激活，从而降低脱靶毒性的风险至关重要。

体内T细胞纳米工程的临床发展

当前体内CAR-T细胞疗法的临床发展主要通过两种主要技术途径推进：基于慢病毒载体的基因治疗和基于mRNA-LNP的瞬时表达系统。Interius BioTherapeutics、Umoja Biopharma和Kelonia等公司利用慢病毒载体进行高效、持久的CAR基因转导，直接在体内将免疫细胞转化为CAR-T细胞。相比之下，Capstan Therapeutics、Myeloid Therapeutics、Orna Therapeutics等公司则采用mRNA-LNP平台实现CAR的瞬时表达，这种方法可能提供更好的安全性，但需要重复给药以维持疗效。这些方法都旨在简化治疗流程，降低成本，并扩大可受益的患者群体。

挑战

尽管体内T细胞纳米工程取得了令人鼓舞的进展，但要释放这种方法在临床应用方面的全部潜力，仍有几个重大挑战需要解决。这些挑战涵盖多个方面，包括靶向特异性、安全性、可扩展性以及免疫系统相互作用的复杂性。例如，实现高度特异性的靶向以避免脱靶效应和毒性仍然是一个主要障碍。纳米颗粒的生物相容性、潜在的免疫原性以及长期安全性需要仔细评估。将实验室规模的制造工艺扩大到满足临床需求所需的水平也面临挑战。此外，体内工程化T细胞与患者复杂且个体化的免疫环境的相互作用需要更深入的理解。

结论

体内T细胞纳米工程领域为免疫疗法和癌症治疗带来了巨大的希望，但目前也面临着若干重大挑战。克服这些障碍需要多学科合作、创新的材料科学以及基因编辑工具和递送方法的持续改进。解决这些难题对于充分发挥这种方法的潜力并将其转化为安全有效的患者疗法至关重要。未来的发展可能集中在提高靶向精度、开发更智能的表达控制系统、优化制造工艺以及更好地理解体内免疫动力学上。通过协调主动靶向、考虑蛋白冠的暴露以及以表达为中心的控制的设计，有望实现可扩展、适应症定制化的体内CAR-T疗法。