电穿孔技术以及对氟掺杂氧化锡表面上固定双层脂质膜的结构完整性分析

《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Electroporation and structural integrity analysis of tethered bilayer lipid membranes on fluorine-doped tin oxide surface

柔性双层脂膜的电穿孔行为与结构稳定性研究显示，2V/2分钟脉冲仅引起可逆的阻抗和SECM响应变化，而5分钟相同电压导致不可逆膜破裂，证实tBLMs的优异电化学稳定性。

　　本研究聚焦于一种名为“固定双层脂质膜”（tBLMs）的生物膜模拟系统，探讨其在电穿孔过程中的行为表现以及对电脉冲的结构稳定性。通过将电穿孔技术与扫描电化学显微镜（SECM）和电化学阻抗谱（EIS）相结合，研究团队能够以高精度的空间和时间分辨率分析膜结构的变化。这种研究方法不仅有助于理解电穿孔的机制，也为开发更有效的药物递送、纳米孔形成以及膜蛋白功能调控等生物电化学应用提供了理论依据。

电穿孔是一种在细胞质膜上形成可逆或不可逆孔道的过程，通常用于将药物或外源性DNA引入细胞，主要应用于治疗目的。当外部电场使跨膜电势超过临界阈值时，会降低孔道形成的能量障碍，从而促进水性孔道的生成。这一过程受到温度、电场强度和膜组成的影响。不同类型的脂质膜在电穿孔过程中表现出不同的行为特征，而这些差异主要源于膜的结构和组成。例如，传统的黑脂质膜（BLMs）虽然在模拟膜组成方面较为理想，但其在实际应用中存在较大的局限性，包括结构脆弱性和需要在膜两侧放置电极的复杂性。相比之下，固定双层脂质膜（tBLMs）因其具有更稳定的结构和可模拟细胞内环境的亚膜离子库，被认为是更接近真实细胞膜的模型。

在本研究中，tBLMs被构建在氟掺杂锡氧化物（FTO）表面，并通过三氯(3-(十八烷基硫代)丙基)硅烷（TOPS）和烯基三氯硅烷（ATS）形成的自组装单层（SAM）进行修饰。该膜由60%的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和40%的胆固醇（Chol）组成，这种脂质比例与哺乳动物细胞膜高度相似。通过SECM技术，研究团队能够在三维电极配置下对膜进行局部电脉冲施加，并实时监测膜结构的变化。研究结果显示，2伏特、2分钟的脉冲仅导致膜阻抗和SECM接近曲线的轻微变化，且这些变化是可逆的，表明膜在电脉冲作用下发生了重组，但并未发生破坏。然而，当电脉冲持续时间延长至5分钟时，膜则发生了不可逆的破坏，表现为阻抗的持续下降和SECM接近曲线中排除区的消失。

这一发现表明，SECM和EIS可以作为互补工具，用于分析双层脂质膜结构的电穿孔行为。通过这些技术，研究团队能够更精确地监测电脉冲对膜的影响，从而深入理解膜在不同条件下的响应机制。此外，研究还指出，与传统的BLMs相比，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的电介质稳定性，这可能与其结构特点有关。tBLMs的外层被大量电解质溶液包围，模拟了细胞外环境，而其内层则与固体支持物之间存在一个厚度为1-2纳米的亚膜离子库，模拟了细胞内环境。这种结构使得tBLMs在引入跨膜蛋白时更具优势，包括形成孔道的毒素和多种非通道型膜蛋白。

在实验方法上，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜结构的动态变化。研究团队还提到，虽然电穿孔在hBLMs（混合双层脂质膜）中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

在实验过程中，研究团队首先对玻璃载片进行了清洗和表面处理，以确保其表面的洁净度和电化学活性。清洗步骤包括使用Alconox?清洁剂溶液在超声波浴中进行清洗，随后用去离子水冲洗，并在浓硫酸中进行1小时的处理，最后在去离子水中浸泡过夜。接着，通过自组装单层技术在FTO表面构建了TOPS和ATS的混合自组装单层（SAM），从而为tBLMs的形成提供了稳定的基底。这种表面处理方式不仅提高了膜的稳定性，还为后续的电穿孔实验提供了良好的实验条件。

在电穿孔实验中，研究团队采用了SECM技术，通过在工作电极和对电极之间测量法拉第电流来监测电穿孔过程。由于电穿孔过程对膜的稳定性要求较高，研究团队选择了一种无媒介体的方法，以避免额外离子对膜系统可能产生的不利影响。这种方法虽然可能在信号放大方面不如传统媒介体方法有效，但能够更精确地反映膜在电场作用下的真实行为。在实验过程中，研究团队施加了不同强度和持续时间的电脉冲，并通过EIS技术实时监测膜的阻抗变化。研究结果表明，较短的电脉冲（如2分钟）仅导致膜的轻微变化，而较长的电脉冲（如5分钟）则会导致膜的不可逆破坏。

通过这些实验，研究团队发现tBLMs在电穿孔过程中表现出较高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。此外，研究团队还指出，与传统的BLMs和hBLMs相比，tBLMs在电穿孔过程中表现出更好的可控性和可逆性，这可能与其独特的结构和组成有关。tBLMs的亚膜离子库不仅模拟了细胞内环境，还为电穿孔过程提供了额外的稳定性，使其在模拟细胞膜行为方面更具优势。

研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。此外，研究团队还指出，通过SECM和EIS技术，可以更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。

在实验方法上，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜结构的动态变化。研究团队还提到，虽然电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

此外，研究团队还指出，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

通过这些实验，研究团队发现tBLMs在电穿孔过程中表现出较高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还指出，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

研究团队还提到，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还指出，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜结构的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

通过这些实验，研究团队发现tBLMs在电穿孔过程中表现出较高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还指出，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

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在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜结构的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

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在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜结构的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能无法完全反映真实细胞膜的行为。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

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研究团队还指出，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

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在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

研究团队还指出，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

通过这些实验，研究团队发现tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

研究团队还指出，tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。通过结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

通过这些实验，研究团队发现tBLMs在电穿孔过程中表现出更高的结构稳定性，尤其是在较低电压和较短持续时间的条件下。这一发现不仅为理解电穿孔机制提供了新的视角，也为开发更有效的生物电化学应用提供了理论支持。结合SECM和EIS技术，研究团队能够更精确地监测电穿孔过程对膜的影响，从而为理解膜的动态变化提供更全面的数据支持。此外，研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs的结构更接近真实细胞膜，其亚膜离子库的存在使得研究结果更具生物学意义。

在实验过程中，研究团队采用了SECM技术，利用铂超微电极（Pt UME）对tBLMs进行空间定位的电穿孔操作，同时对膜进行原位的微米尺度表征。这种方法能够在不破坏周围细胞或组织的情况下，实现对膜的精准操作和实时监测。相比传统的电极配置，这种方法能够以更高的效率进行电穿孔，并且在脉冲后立即测量受影响区域的阻抗变化，从而更准确地捕捉膜的动态变化。研究团队还提到，尽管电穿孔在hBLMs中已有相关研究，但这些研究通常是在缺乏亚膜离子库的条件下进行的，因此可能导致对真实细胞膜行为的误判。相比之下，tBLMs