从人类患者烧伤伤口和医院环境中分离出的铜绿假单胞菌噬菌体的分离与体外评估

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：Isolation and in vitro evaluation of bacteriophages against Pseudomonas aeruginosa isolated from burn wounds of human patients and hospital environment

铜绿假单胞菌烧伤感染中噬菌体分离及其与环丙沙星的协同抗菌研究，通过环境与伤口样本采集确认50/100样本携带该菌，分离出PhPa-6（88%裂解谱）和PhPa-4（60%裂解谱）两种噬菌体，基因组测序显示PhPa-6为186.978kb双链DNA病毒属Siphoviridae，PhPa-4为73.3kb双链DNA病毒属Podoviridae，两者在37-40℃及pH 6-8环境中最稳定，与0.125μg/ml环丙沙林协同作用时抑制率最高达90%。

　　Pseudomonas aeruginosa，作为一种常见的革兰氏阴性细菌，近年来在烧伤患者的感染治疗中引发了广泛关注。特别是在临床环境中，由于其多重耐药性（MDR）特性，P. aeruginosa 已成为全球公共卫生领域的一个重要挑战。这种细菌不仅能够引起慢性医院感染，还可能通过烧伤伤口和医院环境中的多种途径传播，如医疗器械、空气、水以及医护人员的接触等。因此，寻找有效的替代疗法以对抗这种耐药菌株，成为了当前医学研究的重要方向之一。在这一背景下，噬菌体作为一种具有潜力的抗菌治疗手段，因其对特定细菌具有高度特异性、无毒性和可靶向性，正逐渐被重新评估和应用。

本研究的目的是从烧伤病房的环境和烧伤伤口中分离出能够针对P. aeruginosa的噬菌体，并进一步分析其抗菌潜力。研究团队共收集了100个随机的拭子样本，其中50个来自烧伤患者的伤口，另外50个来自烧伤病房的环境。通过对样本进行分子检测，确认了其中50个样本中存在P. aeruginosa，其中35个来自患者的烧伤伤口，15个来自医院环境。这一结果表明，P. aeruginosa在烧伤患者的感染中更为普遍，而其在医院环境中的存在则可能是传播的重要来源。

为了进一步研究噬菌体的抗菌效果，研究团队采用了一种经典的实验方法——琼脂覆盖法，从污水处理厂的污水中分离出七种噬菌体。经过筛选，PhPa-6和PhPa-4这两种噬菌体因其广泛的裂解谱而被选中。PhPa-6的裂解谱覆盖了88%的测试菌株，而PhPa-4则覆盖了60%。这些噬菌体在形态学和遗传学方面的特性也得到了详细分析。例如，PhPa-6属于Siphoviridae家族，具有一个圆形的头部和一个非收缩的长尾，而PhPa-4则属于Podoviridae家族，具有一个较短的尾部。这些结构特征有助于噬菌体识别和裂解特定的宿主细菌。

为了进一步验证这些噬菌体的抗菌效果，研究团队进行了抗生素协同作用的实验。他们选择了常用的抗生素——环丙沙星（Ciprofloxacin），并发现当噬菌体与环丙沙星结合使用时，其抗菌效果显著增强。在实验中，研究团队使用了96孔板，测试了不同浓度的环丙沙星与噬菌体的组合对P. aeruginosa的抑制效果。结果显示，在0.125 μg/ml和0.25 μg/ml的环丙沙星浓度下，噬菌体与抗生素的协同作用分别达到了84%和90%的细菌生长抑制率。这一结果表明，噬菌体能够有效增强环丙沙星的抗菌作用，即使在低于其最低抑菌浓度（MIC）的情况下也能显著减少细菌数量。

此外，研究团队还对这两种噬菌体的稳定性进行了分析。结果显示，PhPa-6在20-40°C的温度范围内表现出较高的稳定性，而PhPa-4则在30-40°C范围内更为稳定。在pH值方面，PhPa-6在pH 7-8时保持稳定，而PhPa-4则在pH 6-8时表现最佳。这些稳定性数据对于噬菌体在实际应用中的存储和使用条件具有重要意义，因为噬菌体在不同环境条件下的活性直接影响其治疗效果。

在基因组分析方面，研究团队通过DNA提取、限制酶消化和高通量测序技术，对PhPa-6和PhPa-4的基因组进行了详细解析。PhPa-6的基因组大小为186.978 kb，GC含量为49.80%，由55个contigs组成。研究发现，PhPa-6编码了6个tRNA基因，这些基因在噬菌体感染过程中可能发挥重要作用，帮助其在宿主细胞内进行蛋白质合成。相比之下，PhPa-4的基因组大小为73.3 kb，GC含量为53.45%，其基因组中未检测到tRNA基因，但含有107个开放阅读框（ORFs），其中94个被鉴定为假基因。通过比较基因组分析，PhPa-6的衣壳蛋白与已知的Pseudomonas噬菌体vB_PaeP_fHoPae04具有高度相似性，而PhPa-4的尾部蛋白则与Pseudomonas噬菌体PJNP053表现出98%的相似性。这些基因组信息不仅有助于理解噬菌体的生物学特性，还为后续的噬菌体疗法研究提供了重要的基础。

在实际应用方面，研究团队发现，将PhPa-6和PhPa-4混合使用可以显著提高对抗多重耐药P. aeruginosa的效果。这种噬菌体混合物在体外条件下表现出良好的抗菌活性，并且能够与环丙沙星协同作用，进一步增强其抗菌效果。然而，尽管这些体外实验结果令人鼓舞，噬菌体疗法在临床应用中仍面临诸多挑战。例如，目前缺乏明确的法规和标准化的使用指南，限制了其在临床实践中的推广。此外，噬菌体在人体内的药代动力学和药效学数据尚不充分，这可能影响其在实际治疗中的应用效果。此外，人体免疫系统可能会对噬菌体产生反应，导致其被清除或引发抗体产生，这可能影响其长期疗效。

综上所述，本研究通过分离和表征两种新型的裂解噬菌体PhPa-6和PhPa-4，展示了它们在对抗多重耐药P. aeruginosa方面的潜力。这些噬菌体不仅在体外条件下表现出良好的抗菌活性，而且在与环丙沙星协同使用时效果更加显著。然而，为了实现其在临床中的广泛应用，还需要进一步的研究来解决相关的法规、药代动力学和免疫反应等问题。未来的研究应重点探讨噬菌体疗法在人体内的安全性和有效性，并通过临床试验验证其实际应用价值。同时，还需要进一步研究噬菌体的稳定性及其在不同环境条件下的表现，以确保其在实际治疗中的可靠性和可持续性。