开发一种针对登革热病毒2型包膜结构域III蛋白的高灵敏度夹心ELISA方法

《Journal of the Indian Chemical Society》：Development of a sensitive sandwich ELISA for the envelope domain III protein of dengue virus type 2

登革病毒2型 envelope domain III蛋白重组表达及基于多克隆抗体的ELISA诊断方法研究。通过优化基因序列并在大肠杆菌中异源表达，获得高纯度DENV-2_EDIII蛋白，免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，建立检测范围为7.8-500ng/mL、检测限0.156ng/mL且无交叉反应的ELISA方法，为登革诊断提供新靶标。

　　随着全球化的加速发展，登革热作为一种快速传播的传染病，正对各国的公共卫生体系造成越来越大的压力。登革热是由登革病毒（DENV）引起的一种蚊媒传染病，目前尚无有效的治疗手段，主要依赖于支持性治疗和对症处理。因此，快速、准确的诊断方法在登革热的防控中显得尤为重要。当前的诊断手段主要包括病毒分离、核酸检测、抗原检测和抗体检测，但这些方法在实际应用中仍然存在诸多局限性，如检测周期长、操作复杂、成本高昂以及易受污染等。特别是抗体检测，虽然在临床中广泛应用，但在某些情况下，如二次感染或感染后期，检测结果可能受到干扰，导致假阴性或交叉反应的问题。

在登革热感染过程中，病毒表面的包膜蛋白（E蛋白）和膜蛋白（M蛋白）在血清中含量较高，成为重要的诊断标志物。E蛋白是病毒与宿主细胞膜结合和融合的关键结构，其结构由三个功能域组成：Domain I（DI）、Domain II（DII，二聚化域）和Domain III（DIII，结合域）。其中，Domain III（EDIII）是E蛋白中具有重要抗原表位的区域，也是病毒受体识别和结合的关键部位。EDIII蛋白具有较强的免疫原性，因此在疫苗开发和免疫诊断中备受关注。然而，尽管EDIII蛋白在疫苗研究中显示出良好的应用前景，但在登革热诊断方面的研究仍较为有限。

为了填补这一研究空白，本研究开发了一种基于DENV-2_EDIII蛋白的高灵敏度、高特异性的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。该方法通过免疫新西兰白兔，制备针对DENV-2_EDIII蛋白的多克隆抗体（pAbs），并利用这些抗体构建了特异性检测EDIII抗原的ELISA系统。实验结果表明，该方法具有较宽的检测范围（7.8 ng/mL至500 ng/mL），最低检测限（LOD）仅为0.156 ng/mL，且在与其他黄病毒属病毒的交叉反应方面表现出良好的特异性。这些特性使得该ELISA方法在登革热的早期诊断和大规模筛查中具有显著优势。

在实际应用中，登革热的诊断面临诸多挑战。由于登革热的早期症状与流感、肠道病毒、细菌感染等多种疾病相似，确诊往往需要依赖于特定的实验室检测手段。此外，二次感染时IgM抗体水平可能显著下降，甚至无法检测到，导致误诊。而IgG抗体检测虽然能够提供免疫反应的信息，但难以区分近期感染与既往感染。NS1抗原检测虽然在感染初期具有较高的灵敏度，但在感染后期由于NS1-IgG免疫复合物的形成，检测效果会受到限制。因此，开发一种新的、更有效的检测靶点和方法对于提高登革热的诊断准确率具有重要意义。

本研究选择DENV-2_EDIII蛋白作为检测靶点，是因为其在病毒感染早期和中期的血清中具有较高的表达水平，并且具有独特的抗原表位，不易与其他病毒产生交叉反应。此外，EDIII蛋白在病毒受体识别和结合过程中发挥关键作用，因此其作为检测靶点具有理论和实践上的双重价值。通过构建基于EDIII蛋白的ELISA系统，不仅能够提高检测的灵敏度和特异性，还能为登革热的快速诊断提供新的技术路径。

在实验过程中，首先从NCBI数据库中获取了DENV-2 E蛋白的完整基因序列，并根据该序列设计了编码EDIII蛋白的基因片段。为了提高在大肠杆菌中的表达效率，对原基因序列进行了密码子优化，使其更符合大肠杆菌的密码子使用偏好。随后，通过重组技术在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中成功表达了DENV-2_EDIII蛋白，并在非变性条件下对其进行了纯化，纯度超过90%。通过免疫新西兰白兔，获得了高滴度的多克隆抗体，并进一步优化了ELISA方法，使其在检测EDIII抗原时具有更高的准确性和重复性。

本研究的成果不仅为登革热的诊断提供了新的方法，也为相关领域的研究开辟了新的方向。特别是在当前缺乏有效治疗手段的情况下，提高诊断的准确性和速度对于控制疫情和减少病死率具有重要意义。此外，随着登革热在全球范围内的传播加剧，开发更高效的诊断工具对于公共卫生管理也至关重要。本研究通过构建基于EDIII蛋白的ELISA系统，为登革热的快速诊断和大规模筛查提供了可行的技术方案。

为了验证该ELISA方法的性能，研究人员对其灵敏度、特异性和重复性进行了系统评估。实验结果显示，该方法在检测DENV-2_EDIII抗原时具有较低的检测限和较高的灵敏度，能够在感染早期阶段准确识别病毒抗原。同时，该方法在与其他黄病毒属病毒的交叉反应方面表现出良好的特异性，避免了误诊的可能性。这些结果表明，基于EDIII蛋白的ELISA方法在登革热的诊断中具有显著优势，能够满足临床对快速、准确检测的需求。

此外，本研究还探讨了EDIII蛋白在疫苗开发中的潜在价值。由于EDIII蛋白具有较强的免疫原性，并且能够诱导中和抗体的产生，因此在疫苗研究中具有重要意义。然而，尽管EDIII蛋白在疫苗开发方面受到广泛关注，但其在登革热诊断中的应用仍需进一步研究。本研究通过构建基于EDIII蛋白的ELISA方法，为登革热的诊断提供了新的思路，并为相关研究提供了实验基础。

总的来说，本研究通过构建基于DENV-2_EDIII蛋白的ELISA方法，不仅提高了登革热诊断的准确性和效率，还为未来的诊断技术发展提供了新的方向。随着对登革热研究的深入，开发更多高效、特异的诊断工具将成为应对这一全球性健康挑战的重要手段。本研究的成果有望为公共卫生机构提供更加可靠的检测方法，从而在登革热的防控中发挥重要作用。