利用计算机模拟技术研究NLuc及其变体功能背后的分子机制

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：In Silico Investigation of Molecular Mechanisms Underlying the Function of NLuc and its Variants

NLuc的结构与功能及其分体系统的性能优化研究，通过分子动力学模拟和对接分析揭示了分体NLuc失效的分子机制，提出基于 allosteric regulation的结构优化策略。

　　NanoLuc（NLuc）是一种源自深海虾 *Oplophorus gracilirostris* 的生物发光酶，其独特的特性使其成为生物实验和成像技术中的重要工具。NLuc的分子量约为19.1千道尔顿，具有单体结构，由11条反平行的β折叠片（β-strands）构成β桶（β-barrel），并由4条α螺旋（α-helices）封闭。这种结构赋予了NLuc高亮度、稳定性和紧凑性，使其在多种生物应用中表现出色。NLuc与底物furimazine（FMZ）结合后，能够发出可见光，这一过程依赖于其独特的化学发光反应。随着对NLuc结构和功能的深入研究，科学家们开发了不同形式的分裂版本，以提高其在复杂实验中的适用性。然而，这些分裂版本在效率和功能方面仍存在一定的局限性，亟需进一步优化。

分裂版本的NLuc通常包括两个或三个组分，其中最常见的是二元系统（binary system）和三元系统（ternary system）。在二元系统中，NLuc被拆分为一个较大的片段（如11S）和一个短肽（如SmBiT或HiBiT），这两个部分可以分别进行操作，并在特定条件下重新组装，以恢复其生物发光功能。三元系统则在此基础上增加了另一个组分，如β9肽，进一步提高了系统的灵活性。这些分裂形式的设计初衷是为了满足不同实验需求，例如在细胞内或活体组织中进行生物发光检测，或者用于构建更复杂的检测系统。然而，实际应用中发现，分裂版本的效率和功能往往不如原始NLuc，这引发了科学家们对分裂机制和结构动态的进一步研究。

研究者通过分子动力学（MD）模拟和结构分析，试图揭示NLuc在不同形式下的结构变化及其对功能的影响。例如，在二元系统中，SmBiT和HiBiT肽分别与11S片段结合，其结合方式和亲和力差异显著影响了整个系统的发光效率。SmBiT具有较低的亲和力，但其结构较为灵活，适合用于某些特定的实验条件；而HiBiT则具有较高的亲和力，能够更有效地与11S片段结合，从而提高系统的发光强度。然而，这些高亲和力的肽在某些情况下可能限制了系统的动态调整能力，导致发光效率下降。此外，三元系统中引入的β9肽虽然增加了系统的功能性，但其与11S片段的结合也带来了新的挑战，如降低系统的稳定性或增加实验操作的复杂性。

在实验过程中，研究人员发现，NLuc的结构动态与其功能表现密切相关。例如，在开放形式（open form）下，NLuc的内部通道较为宽敞，表面口袋（surface pocket）处于未折叠状态，其中Y94氨基酸位于内部通道内。而在闭合形式（closed form）下，内部通道显著变窄或部分折叠，Y94氨基酸则移至通道外部，同时表面口袋重新排列以适应产物furimamide（FMA）的结合。这种结构变化不仅影响了NLuc的催化效率，还对其发光特性产生了重要影响。研究表明，产物的结合能够通过负变构效应（homotropic negative allostery）抑制底物的结合，从而影响整个发光反应的进程。这一机制的揭示为理解NLuc的催化动态提供了新的视角。

为了进一步探讨NLuc的结构和功能关系，研究人员对不同形式的NLuc进行了详细的结构分析和分子动力学模拟。这些模拟不仅包括原始NLuc的开放和闭合形式，还涵盖了二元系统和三元系统中的各个组分。通过这些模拟，研究人员能够观察到NLuc在不同状态下的构象变化，以及这些变化如何影响其功能表现。例如，在二元系统中，SmBiT和HiBiT肽与11S片段的结合方式和动态调整能力，直接影响了整个系统的发光效率和稳定性。而在三元系统中，β9肽的引入虽然提高了系统的功能性，但也可能导致结构的不稳定性，从而影响其在实验中的表现。

此外，研究人员还发现，NLuc的分裂形式在某些情况下可能表现出不同的催化行为。例如，在二元系统中，SmBiT和HiBiT肽的结合可能影响NLuc的催化活性，导致其在某些条件下无法有效催化底物的氧化反应。而在三元系统中，β9肽的引入可能进一步改变NLuc的催化动态，使其在不同实验条件下表现出不同的功能特性。这些发现表明，NLuc的分裂形式在设计和应用时需要考虑多种因素，包括结构稳定性、催化效率以及实验条件的适应性。

为了提高分裂系统的效率和功能，研究人员还对NLuc的结构进行了优化。例如，通过序列优化，某些分裂版本的NLuc在溶剂化能力和热稳定性方面得到了显著提升。然而，这些优化措施并未完全解决分裂系统的效率问题，特别是在某些实验条件下，分裂版本的NLuc可能表现出较低的催化活性或不稳定的结构。因此，进一步的研究仍需关注NLuc的结构动态和催化机制，以找到更有效的优化方法。

总体而言，NLuc及其分裂形式在生物发光研究和应用中具有重要价值。然而，其在实际应用中的表现仍受到多种因素的影响，包括结构稳定性、催化效率以及实验条件的适应性。通过分子动力学模拟和结构分析，研究人员能够更深入地理解NLuc的结构动态和催化机制，从而为优化分裂系统提供理论支持。这些研究不仅有助于提高NLuc在生物实验中的应用效率，还可能为开发新的生物发光技术提供重要的科学依据。