Glutathione S-Transferase在Lasiodiplodia theobromae对多种杀菌剂抗性中的分子机制

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Molecular mechanism of Glutathione S-Transferase involved in resistance to multiple fungicide in Lasiodiplodia theobromae

芒果茎腐病菌 Lasiodiplodia theobromae 多药耐药性中 GST 基因的作用机制研究。通过生物信息学、转录组测序和基因操作，发现 LtGST4 和 LtGST9 基因在耐药菌株中显著上调，其敲除使耐药性降低，过表达则增强耐药性，证实 GST 基因通过代谢解毒参与 fungicide 代谢耐药。

　　这项研究聚焦于芒果茎端腐烂病的病原菌——*Lasiodiplodia theobromae* 对多种杀菌剂产生抗药性的机制。芒果作为热带地区重要的经济作物，其果实易腐烂，导致从采摘到消费的整个过程中有高达25%-40%的损失。其中，*Lasiodiplodia theobromae* 引起的茎端腐烂病是造成这种损失的主要原因之一，具有潜伏感染的特点。由于该病原菌具有广泛的寄主范围和较强的适应能力，因此在农业生产中对这种病害的防治至关重要。

在实际生产中，防治芒果茎端腐烂病主要依赖于农业化学品。然而，随着种植面积的扩大和杀菌剂使用量的增加，杀菌剂抗药性问题日益突出。*Lasiodiplodia theobromae* 通常具有较短的病害周期，因此容易对杀菌剂产生抗药性。在中国，常用的杀菌剂包括苯并咪唑类（MBCs）、呼吸抑制剂（QoIs）和去甲基化抑制剂（DMIs）。这些杀菌剂在控制热带水果的病害方面发挥着重要作用，但随着长期使用，病原菌逐渐发展出对多种杀菌剂的抗药性，即多杀菌剂抗药性（MDR）。

为了深入理解*Lasiodiplodia theobromae* 对杀菌剂的抗药性机制，研究人员采用多种方法进行研究。首先，通过生物信息学、转录组学、qRT-PCR和基因编辑技术筛选和鉴定与多杀菌剂抗药性相关的GST基因。研究发现，SY302菌株对三种杀菌剂——苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵）、呼吸抑制剂（如吡唑醚菌酯）和去甲基化抑制剂（如氟硅唑）均表现出抗药性。进一步研究发现，当使用GST抑制剂二乙基马来酸（DEM）与上述两种杀菌剂联合使用时，杀菌剂的毒性显著增强，SR值（抑制率）从18.46提升至24.00。这表明GST在杀菌剂抗药性中起着关键作用。

通过测定杀菌剂处理后*Lasiodiplodia theobromae* 的GST活性，研究发现抗药性菌株的GST活性显著高于敏感菌株。RNA-Seq分析显示，共有23个GST基因在抗药性菌株中发生表达差异，其中LtGST4和LtGST9基因在抗药性菌株中显著上调。生物信息学分析表明，LtGST4属于Ure2p亚家族，而LtGST9属于GTT1亚家族。通过基因敲除和过表达实验，研究发现当在抗药性菌株中敲除LtGST4和LtGST9基因时，菌株对三种杀菌剂的敏感性显著提高，抗药性降低。相反，当在敏感菌株中过表达LtGST4和LtGST9基因时，菌株对三种杀菌剂的敏感性明显下降，抗药性增强。这表明LtGST4和LtGST9在*Lasiodiplodia theobromae* 的多杀菌剂抗药性中发挥着重要作用，通过介导杀菌剂的解毒作用来增强抗药性。

研究进一步指出，GST基因在植物病原菌中对于杀菌剂抗药性的研究相对较少，尽管在昆虫和杂草抗药性方面已有广泛报道。这说明植物病原菌的代谢抗药性仍是一个有待深入研究的领域。GST作为解毒外源性物质的重要因素，其是否参与调控杀菌剂代谢抗药性尚不明确，因此成为一项有趣的研究课题。

此外，研究还探讨了GST与杀菌剂抗药性之间的协同作用。通过实验发现，使用GST抑制剂DEM与杀菌剂联合处理，能够显著增强杀菌剂的毒性，表明GST在杀菌剂解毒过程中具有重要作用。这些结果为理解植物病原菌的代谢抗药性提供了新的视角，并为未来制定有效的植物病害控制策略提供了理论依据。

研究团队在本研究中采用了多种实验方法，包括：首先，确定GST抑制剂与三种杀菌剂之间的协同作用；其次，测定在杀菌剂胁迫下*Lasiodiplodia theobromae* 的GST活性；第三，利用RNA-Seq和qRT-PCR技术筛选和鉴定与代谢抗药性相关的GST基因；第四，分析GST基因家族的生物信息学特征和表达模式；第五，通过基因敲除和过表达实验研究候选抗药性基因的表达是否与杀菌剂抗药性相关。这些实验方法共同构成了对*Lasiodiplodia theobromae* 多杀菌剂抗药性机制的全面分析。

在实际应用中，多杀菌剂抗药性对农业生产和病害控制构成了重大挑战。随着抗药性菌株的出现，杀菌剂的使用效果逐渐下降，导致需要更高剂量或更频繁地使用杀菌剂，从而可能引发环境问题和病原菌进一步适应。因此，研究*Lasiodiplodia theobromae* 的抗药性机制对于制定可持续的病害控制策略具有重要意义。此外，研究还指出，代谢抗药性不仅影响单一杀菌剂的效果，还可能对具有不同作用机制的杀菌剂产生交叉抗药性，这进一步加剧了病害防治的难度。

通过本研究，科学家们希望揭示GST基因在*Lasiodiplodia theobromae* 多杀菌剂抗药性中的具体作用。研究结果表明，GST基因的过表达是代谢抗药性的重要触发因素，而LtGST4和LtGST9是关键的候选基因。这些发现不仅有助于理解植物病原菌的代谢抗药性机制，还为未来开发更有效的病害控制策略提供了理论支持。例如，通过调控GST基因的表达，可以降低病原菌对杀菌剂的抗药性，从而提高杀菌剂的使用效果。

同时，研究还强调了杀菌剂抗药性管理的重要性。随着抗药性菌株的增多，传统的杀菌剂使用方式可能无法有效控制病害，因此需要采取更加综合的管理措施。这包括使用多种作用机制的杀菌剂组合、减少单一杀菌剂的使用频率、以及探索新的病害控制方法。此外，研究还指出，除了目标位点抗药性外，非目标位点抗药性（如代谢抗药性）也是导致杀菌剂抗药性的重要因素。因此，未来的研究应更加关注非目标位点抗药性机制，以全面了解杀菌剂抗药性的复杂性。

综上所述，这项研究通过多方面的实验方法，揭示了GST基因在*Lasiodiplodia theobromae* 多杀菌剂抗药性中的重要作用。研究结果不仅为理解植物病原菌的代谢抗药性机制提供了新的证据，还为未来制定有效的病害控制策略提供了理论依据。通过调控GST基因的表达，可以有效降低病原菌对杀菌剂的抗药性，从而提高杀菌剂的使用效果，减少病害造成的经济损失。同时，研究也提醒农业生产者，需要更加关注杀菌剂的合理使用，避免因过度依赖单一杀菌剂而导致抗药性问题的加剧。