构建并功能表征一种用于协同降解敌百虫的合成复合体系

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Construction and functional characterization of a synthetic consortium for synergistic degradation of dimethachlon

微生物协同降解dimethachlon及其代谢物的研究，通过构建Bosea sp. S6和Pseudomonas sp. KH-1的合成菌群，实现了对dimethachlon及3,5-二氯苯胺的完全降解，并证实代谢组学中 bins 12和15的关键作用。

　　

吴明辉|卢培成|冯友慧|何珊珊|韩国民|胡顺利

安徽农业大学生命科学学院，中国合肥230036

摘要

残留的双羧酰胺类杀菌剂二甲四氯及其主要代谢物3,5-二氯苯胺对健康和生态具有显著风险。微生物降解能有效减轻相关环境风险。有机污染物的微生物降解是一个复杂的过程，通常由微生物群落而非单一物种共同完成。然而，关于协同微生物群落对二甲四氯生物降解的研究仍较为有限。在本研究中，我们获得了一个能够降解二甲四氯的富集细菌群落JHJ-2。我们构建了一个合成群落，包括Bosea sp. S6（将二甲四氯转化为3,5-二氯苯胺）和Pseudomonas sp. KH-1（降解3,5-二氯苯胺）；这两种菌株均来自富集群落JHJ-2，并且能够协同降解二甲四氯。利用斑马鱼进行的毒性测试表明，该合成群落（S6和KH-1菌株）可将二甲四氯转化为无毒产物。通过添加该合成群落，受污染土壤中的二甲四氯及其高毒性代谢物3,5-二氯苯胺被完全清除。此外，通过宏基因组分析成功分离出16个功能模块，包括模块12（Bosea sp.）和模块15（Pseudomonas sp.），并在模块12和15的基因组中发现了几种潜在的降解酶。总体而言，所开发的合成群落在增强二甲四氯污染场所的生物修复和解毒方面展现出巨大潜力。

引言

双羧酰胺类杀菌剂，如丙环唑、异丙环唑、乙烯菌核利和二甲四氯，常被用作防治植物真菌病的保护剂（Sarker等人，2022年；Zubrod等人，2019年）。作为主要的双羧酰胺类杀菌剂，二甲四氯被广泛用于控制多种作物的真菌病害（Firoz等人，2016年）。二甲四氯在环境中的残留引发了严重关注，因为其本身及其代谢物都可能对环境和生物（包括人类）造成危害（Vasileiadis等人，2018年）。必须考虑由有机有毒化合物衍生的代谢物的潜在毒性，因为这些代谢物可能与其母体化学物质一样有害或更具毒性（Idowu等人，2019年；McCarrick等人，2019年）。研究表明，3,5-二氯苯胺是二甲四氯在环境和植物中的主要代谢物（Lai等人，2021年）。然而，3,5-二氯苯胺是一种致癌化合物，由于其更高的毒性和更长的持久性，其危害性大于二甲四氯本身（Rifai等人，2013年；Vasileiadis等人，2018年）。因此，彻底清除二甲四氯及其代谢物3,5-二氯苯胺的环境残留对于降低生态风险至关重要。

微生物降解被视为消除有机污染物及其代谢物的可持续方法，从而保护人类和环境健康（Huang等人，2017年）。已分离出四种纯细菌菌株，包括Providencia stuartii菌株JD、Brevundimonas naejangsanensis菌株J3、Paenarthrobacter sp.菌株JH-1和Arthrobacter sp.菌株K5，并证实它们具有降解二甲四氯的能力（Qian等人，2024年；Zhang等人，2019年、2020a年、2022年）。已经探索了涉及二甲四氯降解的潜在催化途径。P. stuartii菌株JD首先将二甲四氯转化为3,5-二氯苯胺，随后通过中间代谢物苯酚和粘康酸进一步矿化（Zhang等人，2019年）。B. naejangsanensis菌株J3首先将二甲四氯水解为3,5-二氯苯胺，然后通过中间代谢物苯酚进一步矿化（Zhang等人，2020a年）。然而，Paenarthrobacter sp.菌株JH-1和Arthrobacter sp.菌株K5只能将二甲四氯转化为3,5-二氯苯胺，无法实现其完全矿化（Qian等人，2024年；Zhang等人，2022年）。这种不完全的降解对人类健康和生态系统安全构成了更大威胁。

环境中的大多数复杂有机污染物是通过微生物群落的共生和代谢作用分解的，而非由单一微生物菌株完成（Li等人，2022年）。在有毒有机化合物的环境生物修复中，微生物群落凭借其强大的代谢互补性和合成能力优于单一微生物菌株（Wanapaisan等人，2018年；Xu等人，2024年）。许多细菌群落已展现出对阿特拉津（Xu等人，2019年）、双酚A（Yu等人，2019年）、四氢呋喃（Liu等人，2017年）、利隆（Zhang等人，2018年）、碳氢化合物（Eze等人，2021年；Eze等人，2021年）和四溴双酚A（Wu等人，2025年）等有机污染物的完全降解和解毒能力。与单一微生物菌株相比，这些微生物群落通过交叉喂养、降低产物毒性、分泌促进生长或降解物质以及缓解环境压力等机制表现出更高的代谢效率（Eze等人，2022年；Xu等人，2019年）。

在本研究中，我们采用富集策略获得了一个名为JHJ-2的细菌群落。从富集群落JHJ-2中分离出的S6和KH-1菌株被组合起来，形成了一个稳定的合成群落用于降解二甲四氯。评估了该合成群落（S6和KH-1菌株）的解毒能力及其在修复二甲四氯污染土壤方面的潜力。此外，我们利用宏基因组方法研究了合成群落（S6和KH-1菌株）中的协同降解机制。我们的发现显著提高了对群落水平上二甲四氯协同降解的理解，为应用合成群落消除二甲四氯残留和修复环境污染奠定了基础。

化学物质和培养基

二甲四氯（CAS：24096–53-5，纯度99%）和3,5-二氯苯胺（CAS：626–43-7，纯度98%）购自上海源业生物科技有限公司（中国上海）。此外，4-(3,5-二氯苯胺基)-4-氧丁酸（CAS：53219–95-7，纯度98%）购自上海纳福生物科技有限公司（中国上海）。使用丙酮配制了浓度为5000 mg L^?1的二甲四氯储备溶液，甲醇用于配制4-(3,5-二氯苯胺基)-4-氧丁酸和3,5-二氯苯胺的储备溶液。

富集群落JHJ-2的功能表征

在本研究中，从一个农业土壤样本中通过连续富集获得了一个能够降解二甲四氯的细菌群落JHJ-2。当将富集群落JHJ-2接种到以二甲四氯为唯一碳源的MSM培养基中时，100 mg L^?1的二甲四氯在3天内被完全降解至检测限以下（图1a）。此外，富集群落JHJ-2不仅完全降解了二甲四氯，而且没有检测到其积累。

结论

本研究获得了一个能够降解二甲四氯的富集细菌群落JHJ-2。随后构建了一个合成群落，其中包含Bosea sp. S6（将二甲四氯转化为3,5-二氯苯胺）和Pseudomonas sp. KH-1（降解3,5-二氯苯胺），这两种菌株均来自富集群落JHJ-2。模块12（Bosea sp.）和模块15（Pseudomonas sp.）在二甲四氯的降解过程中发挥协同作用，其中包含几种潜在的降解酶。

CRediT作者贡献声明

吴明辉：研究、数据整理、初稿撰写。卢培成：数据可视化、数据整理。冯友慧：研究、数据整理。何珊珊：方法学设计、研究。韩国民：监督、资金获取。胡顺利：撰写、审稿与编辑、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（项目编号：32300088）的资助。