综述：细胞衰老——活细胞显微镜技术中的一个相关因素（小型综述）

《Progress in Biophysics and Molecular Biology》：Cell aging - a relevant factor in live cell microscopy (mini-review)

这篇综述深入探讨了细胞衰老对先进显微镜技术（如超分辨率成像、FLIM、VA-TIRFM）和激光显微操作（如光穿孔）实验结果的关键影响。文章强调，细胞传代次数和衰老标志物会显著改变亚细胞结构（如染色质、线粒体、膜流动性）和功能，进而扭曲显微镜读数的准确性，是实验设计中不可忽视的变量。

　　

细胞衰老——活细胞显微镜技术中的一个相关因素

摘要

活细胞显微镜技术在研究细胞对环境信号的反应行为方面正变得越来越重要。然而，细胞衰老会导致各种细胞结构和功能的改变，影响甚至扭曲基于显微镜的读数。这篇小型综述简要讨论了细胞衰老如何影响关键的亚细胞区室并改变活细胞成像的结果。与许多关于细胞衰老的论文不同，本文重点关注细胞衰老对先进显微镜技术和显微操作技术性能及结果的影响。我们的发现强调了在实验设计和数据解读中考虑细胞传代次数和衰老标志物的重要性。

1. 引言

生物医学光学研究通常基于使用细胞培养物、溶液或组织模型的体外实验。使用培养的细胞系是临床前研究和开发不可或缺的一部分，可提供有关细胞生理学、代谢途径、疾病相关过程以及评估药物作用的有价值信息。然而，获得的结果可能因多种因素而异，其中细胞衰老是一个经常被低估的重要变量。衰老可由遗传倾向引起，也可由外部应激因素诱导，包括电离辐射、紫外线照射、缺氧或有毒物质。

多种显微镜技术被认为与研究细胞衰老相关。这些技术包括透射显微镜、弹性和非弹性散射显微镜以及基于荧光的显微镜。其中，荧光显微镜是生命科学中最广泛使用的技术。重要的基于荧光的方法包括超分辨率显微镜、微光谱分析、荧光寿命成像、F?rster共振能量转移和全内反射荧光显微镜。此外，激光辅助显微操作技术为细胞分析和靶向干预提供了宝贵信息。

本文特别关注细胞衰老如何影响并常常扭曲生物医学光学，尤其是光学和荧光显微镜背景下的实验结果。我们重点介绍了应用先进成像方法研究不同传代次数培养细胞中核结构、能量代谢、膜动力学或药物反应，强调了细胞衰老对关键显微镜读数的影响。

2. 活细胞显微镜与细胞衰老

2.1. 细胞衰老对亚细胞区室的影响

衰老或衰老可以影响细胞的各个领域，包括细胞核、线粒体、细胞骨架和/或细胞膜。这可能导致细胞区室结构和功能的各种变化，影响细胞形态、细胞内组织、机械特性以及蛋白相互作用。

2.1.1. 细胞核

细胞衰老的一个效应是细胞生长停滞，细胞周期停止。这可能是由于接触抑制、生长因子缺乏或DNA损伤等原因造成的。核结构和染色质微结构的改变是细胞衰老的另一个迹象。

由于基因调控、基因组稳定性和细胞响应环境信号的能力在衰老过程中发生显著改变，因此预计染色质纳米结构的相应修饰也会发生。例如，与年龄相关的组蛋白乙酰化和甲基化模式的改变可能导致基因组结构变化，如染色质松弛或异染色质修饰。此外，衰老相关的异染色质灶与异染色质衰老调节因子的募集相一致。不规则的核形态，如核膜内陷和核膜完整性丧失，与Lamin功能降低有关。

为了进一步分析，需要具有更高光学和结构分辨率的方法。超分辨率显微镜允许克服这一基本限制。研究表明，细胞核内具有高绝对DNA密度（足以限制转录因子复合物可及性）的区域构成了核体积和DNA含量的相当大部分。衰老相关的核内高/低密度DNA域景观的变化预计与转录速率的变化相关。

在其他研究中，SRM被用于监测和分析电离或UV辐射后染色质压缩或断裂的变化。使用单分子定位显微镜，研究了与DNA单链和双链断裂相关的X射线诱导的核染色质构象变化。此类方法将允许详细研究与年龄相关的染色质纳米结构修饰。

目前，核基因组组织的研究大多在固定的非衰老细胞水平上进行。为了更好地理解其在衰老细胞中的动力学，非常需要采用更高分辨率的活细胞显微镜方法。由于长时间显微镜观察伴随的高光子负荷，这仍然是一个重大挑战。为了减少此类问题，单粒子追踪技术已成功用于研究与核纳米结构分析和转录相关的染色质运动。在此类研究中，与年龄相关的细胞核变化可能通过影响荧光标记效率、染色质可及性或修复动力学来扭曲活细胞成像。

总之，基因转录和染色质纳米结构之间新出现的相关性为分析衰老效应开辟了新途径，不仅可以从生化角度，还可以将其与单细胞/单分子水平的直接显微镜测量相结合。

2.1.2. 线粒体

衰老对线粒体的影响可能影响其功能、形态以及呼吸链的功效和动力学。这可能导致相关分子物种光学特性的改变，原因是膜电位降低、mtDNA突变和活性氧化应激的变化。通过各种SRM方法，如STED显微镜、SMLM或SIM，也建立了在纳米尺度上探索线粒体动态特性的方法。使用JC-1等荧光染料来评估线粒体膜电位的变化。与年龄相关的线粒体变化可以改变荧光强度、荧光团定位，并引起自发荧光增加，从而影响测量并降低信号特异性。

2.1.3. 内质网

内质网中的衰老可导致结构解体和功能下降，引起未折叠或错误折叠蛋白质的积累和应激水平升高。因此，细胞信号传导可能受到影响，导致异常囊泡形成和内吞功能障碍。超分辨率显微镜技术已被用于可视化活细胞中内质网网络的结构和蛋白质错误折叠。此外，相衬显微镜和基于荧光的显微镜足够灵敏，可以捕获由错误折叠蛋白质积累引起的内质网折射率变化或荧光猝灭。此类与年龄相关的内质网变化可能影响荧光团与特定靶标的结合，并扭曲明场对比度，从而影响显微镜读数的可视化和量化。

2.1.4. 细胞骨架

由于衰老，细胞骨架网络可能经历肌动蛋白丝的解体、微管的不稳定性以及中间丝表达水平的变化。这些变化可能影响细胞形状、机械特性和运动性，由微管刚性受损和细胞内运输受损引起。活细胞成像，例如3D成像和活细胞追踪，已被用于监测细胞骨架刚度、结构变化和迁移动力学。衰老的细胞骨架表现出刚度增加、迁移减少以及对外部刺激反应变慢。此外，衰老细胞中由于细胞质包涵体积累而表达的强自发荧光会干扰基于荧光的成像系统。

2.1.5. 细胞膜

细胞衰老可显著影响膜的刚度。更具体地说，由于脂质组成的改变，包括胆固醇含量增加，衰老时膜刚度增加和流动性降低被证实。细胞膜中富含胆固醇的微区，通常称为脂筏，在膜组织和功能中起主要作用，并且似乎是细胞衰老的主要目标。此外，细胞衰老会影响膜蛋白的行为、信号通路的激活和内吞作用，影响细胞对药物或纳米材料等物质的反应。膜完整性降低导致渗透性增加和调节离子流的能力降低，从而导致衰老细胞中的渗透应激和机械损伤。

为了评估膜的刚度和流动性，极性敏感染料，如膜标记物laurdan，已被广泛使用。Laurdan显示出两个特征性荧光带，分别约在440 nm和490 nm。第一个带在更刚性的凝胶相细胞膜中占主导地位，后者在更流动的液晶相中占主导地位。先前，引入了“广义极化”参数，这是一个用于膜刚度的合适参数：GP = (I₄₄₀ - I₄₉₀) / (I₄₄₀ + I₄₉₀)，其中I₄₄₀和I₄₉₀分别是在440 nm和490 nm测量的荧光强度。GP在24°C至41°C之间随着温度升高而显著降低，并且随着细胞衰老而增加，表明膜刚度更高。此外，质膜中的GP始终高于细胞内膜内的GP。膜刚度的进一步参数包括纳秒荧光寿命和旋转相关时间，两者都随着温度升高而降低。

一个有趣的发现是荧光寿命的细胞分布。年轻的传代培养物表明异质的寿命域，而衰老的传代培养物显示出更均匀的寿命模式。这证明，定量实验，如胆固醇依赖性病理学（包括癌症、动脉粥样硬化或神经退行性疾病），需要相似年龄的细胞培养物。应用适当的筏标记物可以提供有关所涉及机制的额外信息。

2.2. 细胞衰老对药物反应的影响

文献报道化疗药物可诱导细胞凋亡以及衰老。然而，只有个别研究案例描述了细胞衰老对细胞毒性药物功效的影响，并且几乎没有定义用于细胞衰老表征的标准化参数。此外，细胞衰老对各种药物或纳米颗粒的摄取有影响，这主要是由于其膜或细胞骨架的弹性特性发生变化，并可能引发不同的细胞反应。细胞衰老也影响核仁的特性，包括核糖核蛋白颗粒的生物发生，以及线粒体完整性，其中膜电位的测量可能受到影响。

先进的成像技术允许检测由细胞衰老引起的药物摄取的细微变化。在一篇关于细胞对细胞抑制药物阿霉素反应的文章中，我们研究了中国仓鼠卵巢细胞或MCF-7人乳腺癌细胞表面与其生长的相邻玻璃基质之间的距离。使用可变角度TIRFM，我们观察到当使用具有更多传代次数的亚培养物时，细胞-基质距离减少了最多2倍。2小时或24小时的阿霉素处理导致细胞-基质距离增加最多两倍。然而，评估药物对细胞-基质距离的影响需要受控的细胞年龄。

2.3. 细胞衰老对能量代谢的影响

细胞衰老对能量代谢有显著影响，主要是由于氧化还原平衡的改变和线粒体功能障碍。大多数关于细胞能量代谢的研究主要集中在ATP合成和参与氧化还原酶的辅酶周转的荧光测量上。其中，FMN、FAD、NADH和NADPH在代谢氧化还原反应中起主要作用。在近紫外光谱范围激发时，NADH和NADPH在其还原态发出荧光，但在其氧化态几乎不发光。因此，荧光测量可以为相关代谢过程，特别是糖酵解和呼吸的功效提供有价值的见解。

据报道，糖酵解和呼吸主要与游离NADH和蛋白质结合NADH分子有关。这两种分子物种的区别在于其发射最大值，游离NADH约为480 nm，结合NADH约为440 nm，以及它们在亚纳秒范围内的荧光寿命。在先前的研究中，基于这些光谱和寿命数据，通过多变量数据分析，区分了肿瘤细胞和恶性程度较低的细胞系。例如，在140次单独测量中，观察到U251-MG胶质母细胞瘤细胞中480 nm波段占主导地位，而在具有激活肿瘤抑制基因的恶性程度较低的细胞中，440 nm波段更明显。

细胞衰老是否改变NADH物种的相对组成是一个悬而未决的问题。比较具有不同细胞传代次数的小鼠3T3成纤维细胞小簇的自发荧光表明，虽然光谱由440 nm和480 nm的发射带主导，但它们的相对强度保持不变。尽管从所示结果不能推断出代谢途径与年龄相关的变化，但文献中已经讨论了NADH荧光与细胞衰老（包括线粒体功能障碍）之间可能的相关性。此外，NAD⁺水平的降低与许多衰老相关疾病有关。

2.4. 细胞衰老对激光微束反应的影响

除了光学显微镜，激光微束技术的众多应用已被报道和总结，包括细胞区室或细胞器的选择性照明、结构和功能研究、光学捕获和操作或显微切割。虽然激光微束通常用于测量或成像生物参数，以及在光学镊子系统中捕获或移动细胞，但显微操作或光穿孔技术已被用于暂时增加细胞膜通透性，以将分子或小颗粒引入细胞。这些技术与通过微针注射竞争，具有保持细胞活力的额外优势，因为诱导的扰动是可逆的。

激光辅助光穿孔基于光化学、光热或光机械相互作用，取决于激光参数，可用于将特定染料分子或外来生物的基因引入细胞。光机械相互作用与皮秒或飞秒激光脉冲烧蚀在质膜上产生小孔有关，而光热相互作用包括膜中小点的瞬时升温，可能伴随膜脂从刚性凝胶相到更流动的液晶相的相变。在应用GFP编码质粒后，我们证明了在年轻的CHO细胞亚培养物中，转染率从6.5 ± 2.5%增加到约29%。当包括所有亚培养物时，转染效率约为13%。这些结果与年龄相关的膜刚性有关，可能是由于胆固醇含量增加，因此预计相变发生在更高温度，并且分子（如GFP编码质粒）的摄取受到阻碍。

除了转染，激光微束技术已被用于照射静脉内皮细胞，从而诱导硬化，这是高血压的一个标志，尤其与老年人口相关。此外，在DNA损伤和修复的背景下，据报道激光微束会随着时间的推移积累错误修复的DNA链，表明这些技术被证明是衰老研究中的宝贵工具。更近期的研究侧重于不同细胞类型在应激和衰老诱导条件下的粘性和粘弹性特性，以更深入地了解衰老过程和衰老相关疾病。例如，光学镊子微流变被用于快速表型细胞内材料特性和蛋白质混合物，用于细胞衰老研究，具有进一步的生物医学和药物筛选应用。

3. 结论与未来方向

核基因组结构、与能量代谢相关的辅酶以及细胞膜和细胞骨架的机械特性可能对细胞衰老敏感，影响广泛的基于显微镜的读数。细胞的传代次数通常被忽视，尽管它明显影响荧光强度、光谱特性、机械特性和分子摄取。因此，比较性体外实验应使用年龄匹配的细胞，例如具有相似传代次数的细胞。实施细胞年龄度量标准化，如传代次数和复制年龄标志物，特别是在长期成像和药物测试分析中，将有助于确保数据可重复性并消除数据变异性。或者，可以采用策略来避免或延迟细胞衰老效应，例如使用抗氧化剂或消耗胆固醇。在第一种情况下，可以防止活性氧导致的DNA损伤或线粒体功能障碍，而在第二种情况下，可以使用例如MβCD来避免衰老细胞膜刚度的增加。保持可比较的细胞年龄或最小化细胞衰老在生物医学光学的高度敏感实验中起着关键作用，包括活细胞显微镜。

在测量时间长的情况下，光毒性是活细胞成像中的一个限制因素，尤其是在超分辨率成像中。进一步优化成像技术，如FLIM、SRM、TIRFM和VA-TIRFM，结合自适应光学、高效探测器和AI辅助图像重建，有助于提高成像分辨率并减少对细胞的光毒性损伤。此外，新兴的高分辨率成像技术结合机器学习引导的表型分类可以帮助在单细胞水平区分衰老表型。

从生物学角度来看，进一步探索细胞器衰老与基于显微镜的结构和功能读数之间关系的研究可以增强我们对代谢衰老及其对细胞特征（如氧化还原状态、染色质纳米结构和机械行为）影响的理解。此类信息改进了实验设计，并提供了预测和避免细胞衰老对细胞分析影响的可能性。

此外，将高通量系统与超分辨率成像技术相结合允许同时分析数千个细胞。这种方法提供了表征大细胞群体中衰老表型的机会，并可应用于各种研究或诊断领域，包括药物筛选、衰老诊断和细胞 rejuvenation 策略。类似地，先进的显微镜引导成像工具可以扩展到显微镜引导的操作技术。这包括在年龄选择性转染或 rejuvenation 药物递送中应用激光基光穿孔，通过光生物调节研究膜流动性或细胞骨架张力，或使用靶向消融在共培养中激活衰老细胞。此类操作技术有助于先进的治疗方法，并为再生医学和年龄相关疾病治疗提供更好的见解。