基于微生物组的空气细菌特征分析，以支持洁净室环境中的微生物风险评估

《Regenerative Therapy》：Microbiome-based profiles of airborne bacteria to support microbial risk assessment in cleanroom environments

DNA测序技术揭示清洁室内微生物群落结构及操作人员污染风险。通过16S rRNA基因扩增测序分析不同洁净度（B/C/D级）环境空气样本，发现皮肤相关菌（如Cutibacterium、Corynebacterium）在B/C级中出现显著分布不均，其偏态系数和峰度值高于环境菌（Bacillus、Paracoccus）。尽管α/β多样性指标无统计学差异，但时空动态分析显示人员流动和局部操作是主要微生物分布影响因素。研究证实传统培养法无法全面评估空气微生物风险，需结合分子检测建立动态评估体系。

　　在现代生物医学研究与生产过程中，维持无菌环境至关重要。特别是对于涉及活细胞的细胞产品加工，确保环境微生物污染风险最小化是保障产品安全性的关键。然而，传统的微生物监测方法，如粒子计数和基于培养的菌落形成单位（CFU）检测，存在一定的局限性。这些方法无法全面反映空气中微生物的多样性和来源，因为许多微生物无法在标准培养基上生长，或者需要特殊的培养条件。因此，采用基于DNA的微生物组分析技术，能够更全面地揭示微生物的组成、分布和潜在风险，成为评估清洁室微生物污染的新途径。

本研究聚焦于清洁室环境中的微生物群落结构，通过高通量DNA测序技术对不同清洁等级（B、C、D）的空气中微生物进行系统分析。研究团队采集了来自东京科学研究所医院细胞加工设施的空气样本，并利用16S rRNA基因扩增子测序技术对微生物群落进行了深入解析。这种方法能够识别出无法通过传统培养方法检测到的微生物种类，从而更准确地评估微生物污染的潜在风险。研究结果表明，尽管不同清洁等级之间的微生物多样性未显示出显著差异，但某些微生物的出现可能与操作人员的行为密切相关，如皮肤相关细菌的临时性增加。

研究中发现，清洁室环境中普遍存在一些皮肤相关的微生物，例如*Cutibacterium*和*Corynebacterium*，这些细菌通常存在于人体表面，并可能通过操作人员的活动引入到空气中。此外，环境相关的微生物如*Bacillus*和*Paracoccus*也广泛存在，这些微生物可能来源于建筑材料、通风系统或水循环系统。值得注意的是，虽然这些微生物在不同清洁等级中均被检测到，但它们的分布模式和丰度却受到多种因素的影响，如操作人员的流动、工作内容的变化以及局部气流的波动等。

通过使用QIIME2软件进行生物信息学分析，研究团队对样本进行了分类和可视化处理。他们排除了可能来源于试剂的*Escherichia coli*序列，以确保数据的准确性。分析结果显示，清洁等级对微生物群落的组成和多样性没有显著影响，但某些微生物的出现频率和分布模式确实与操作人员的行为有关。例如，在高清洁等级（如Grade B）环境中，皮肤来源的微生物表现出更高的变异性和不稳定性，而环境来源的微生物则显示出相对稳定的分布特征。

研究还发现，不同培养基对微生物的回收效率存在显著差异。某些特定培养基，如羊血琼脂和海水琼脂，能够支持某些营养需求较高的微生物生长，而这些微生物在标准培养基（如SCD琼脂）上则难以检测。这表明，传统培养方法可能低估了某些微生物的污染风险，尤其是在涉及复杂微生物群落的环境中。因此，研究强调了采用多样化培养基和DNA测序技术的重要性，以更全面地了解空气中的微生物组成。

通过分析不同微生物群落的α多样性指数（如观察到的OTU丰富度、香农指数和Faith PD指数）以及β多样性指数（如加权和非加权UniFrac距离），研究团队发现清洁等级对微生物群落的整体结构和多样性影响有限。尽管某些微生物的相对丰度在不同等级之间存在细微变化，但这些变化并未达到统计学意义上的显著性。这一发现表明，清洁等级可能并不是决定微生物群落组成的主要因素，而更多是与操作人员的行为和环境动态变化相关。

研究还通过分析偏度和峰度等统计指标，进一步揭示了不同微生物群落的分布特性。结果显示，在Grade B和Grade C环境中，皮肤相关微生物表现出更高的偏度和峰度，表明它们的出现具有更高的偶然性和动态性。而在Grade D环境中，皮肤来源和环境来源的微生物分布模式相似，这可能意味着在高度清洁的环境中，皮肤来源的微生物污染风险并未完全被排除，反而可能在某些情况下更为突出。

这些发现对于改进清洁室的微生物监测策略具有重要意义。传统方法虽然能够提供基本的微生物污染信息，但可能遗漏了部分关键微生物的潜在影响。因此，结合DNA测序技术和多种培养基的综合分析，能够更全面地评估微生物污染的风险。此外，研究还指出，微生物的分布和丰度可能受到多种非传统的因素影响，如局部气流、操作时间、人员流动等，这些因素需要在未来的监测策略中加以考虑。

本研究的局限性也值得关注。首先，采用的16S rRNA基因扩增子测序技术主要针对V3–V4区域，这可能限制了对某些密切相关物种和菌株的区分能力。其次，由于采样时间、频率和空间范围的限制，研究未能充分捕捉微生物群落与操作因素之间的因果关系。未来的研究需要进行更长时间、更广泛的采样，并结合操作日志和粒子动态数据，以更深入地理解微生物污染的来源和传播机制。此外，微生物的分类主要依赖于文献中的功能属性，这可能导致某些微生物的来源归属不够精确。因此，未来研究应结合更精确的分类方法，如功能基因组学或转录组学，以更全面地评估微生物对产品安全的影响。

总体而言，本研究为清洁室环境中的微生物监测提供了新的视角。通过基于DNA的微生物组分析，能够更准确地识别和评估空气中的微生物污染风险，特别是在那些传统方法难以检测到的微生物种类。研究结果表明，微生物的分布和丰度不仅受到清洁等级的影响，还与操作人员的行为、环境动态变化以及局部条件密切相关。因此，未来的微生物监测策略应更加注重对微生物来源和传播路径的深入分析，以实现更精准的微生物风险评估和控制。同时，研究也强调了需要进一步探索微生物的功能特性，如致病性、抗生素耐药性和生物膜形成能力，以全面评估其对细胞产品安全性的潜在影响。