整合网络药理学、分子对接技术和实验验证方法，探讨补阳还五汤对脑缺血性中风的保护作用

《Results in Chemistry》：Integrating network pharmacology, molecular docking and experimental verification to explore the protective effect of Buyang Huanwu Decoction on cerebral ischemic stroke

脑缺血性中风（CIS）的细胞损伤机制及中药复方 BYHWD 的多靶点调控作用研究。通过网络药理学预测和分子对接验证，发现 BYHWD 及其活性成分槲皮素通过抑制 TNF-α 表达，调控 PI3K-Akt、IL-17 等信号通路，有效改善 OGD/R 模型 HT22 细胞的存活率及炎症反应。CCK-8、ELISA 和 Western blot 实验进一步验证了槲皮素与 TNF-α 的直接相互作用及剂量依赖性保护效应。BYHWD 的多成分、多靶点、多通路协同机制为其临床应用提供了实验依据。

　　脑缺血性卒中（Cerebral Ischemic Stroke, CIS）是全球最常见的卒中类型之一，对公共健康和社会经济状况造成了重大影响，尤其是在老年人群中表现尤为突出。目前，针对促进卒中后功能恢复的治疗手段仍较为有限，因此，探索新的治疗策略显得尤为重要。中药复方“补阳还五汤”（Buyang Huanwu Decoction, BYHWD）因其在治疗缺血性卒中方面的潜力，被广泛研究。然而，其具体的细胞和分子机制尚未完全明确。本研究通过网络药理学预测和体外实验验证，揭示了BYHWD及其活性成分槲皮素（Quercetin）在HT22神经元细胞中对缺氧-缺糖再灌注（Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion, OGD/R）损伤模型的抑制作用，为BYHWD在CIS治疗中的应用提供了实验依据。

网络药理学分析表明，BYHWD中的多种成分，包括槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇和黄芩素，可能通过多种信号通路，如PI3K-Akt、IL-17和TNF信号通路，发挥其治疗效果。这些成分与关键蛋白靶点AKT1、IL6、TNF-α、IL1β和TP53等相互作用，从而影响相关生物过程和信号传导。通过CCK-8实验，发现BYHWD提取物和槲皮素显著提高了OGD/R诱导的HT22细胞的存活率，且效果呈现浓度依赖性。进一步的生物分子相互作用分析确认了槲皮素与TNF-α的直接相互作用，且在不同浓度下，BYHWD和槲皮素均能有效降低TNF-α蛋白表达。Western blot分析也支持了槲皮素对TNF-α表达的抑制作用，表明其在细胞水平上具有显著的保护作用。

BYHWD在治疗CIS中的作用机制复杂，具有多成分、多靶点和多通路的特点。其中，TNF-α和槲皮素被识别为关键的治疗靶点和活性成分。两者均能有效抑制TNF-α介导的炎症反应，减轻细胞损伤，从而发挥神经保护作用。本研究通过整合网络药理学、分子对接和实验验证，系统地探讨了BYHWD的活性成分及其作用机制，为中药在CIS治疗中的应用提供了科学证据，并揭示了其多靶点治疗潜力。

在研究方法上，首先从GEO数据库中获取了63个样本（包括39例缺血性卒中患者和24名健康对照），利用“Affy”和“Oligo”包进行数据导入和标准化处理，通过“limma”包筛选出差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。随后，通过多个在线数据库（如TCMSP、GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD和CTD）预测BYHWD和CIS的靶点，确保数据的完整性和准确性。使用UniProt数据库对靶点进行标准化命名，并通过VENNY 2.1工具识别出两者的共同靶点。这些共同靶点被用于构建“药物-疾病”网络图，进一步分析其潜在治疗作用。

在分子对接分析中，选取了五种小分子化合物（山柰酚、槲皮素、豆甾醇、黄芩素和β-谷甾醇）与TNF-α、AKT1、IL6、IL1β和TP53等靶点进行模拟。结果表明，槲皮素在几乎所有靶点上均表现出较强的结合亲和力，而TNF-α则与各化合物具有良好的结合能力。槲皮素与TNF-α的复合物被可视化，并分析其结合方式。实验结果证实，槲皮素在不同浓度下均能有效降低TNF-α的表达水平，从而减轻炎症反应和细胞损伤。

在体外实验验证中，首先通过不同浓度的EDARAVONE（EDA）评估其对OGD/R模型的影响，确定其最佳浓度为100 μM。随后，对BYHWD提取物和其活性成分在不同浓度下的作用进行了评估。结果显示，BYHWD在0.05至0.25 mg/mL范围内具有显著的保护作用，且在50 μM和100 μM浓度下，槲皮素、山柰酚、苦杏仁苷、芍药苷和黄芪苷均表现出良好的保护效果。其中，槲皮素在25 μM和50 μM浓度下具有显著的保护作用，而其他成分则在50 μM浓度下效果更明显。

通过ELISA和Western blot实验，进一步验证了BYHWD和槲皮素对TNF-α表达的影响。结果表明，与对照组相比，OGD/R模型组的TNF-α表达显著升高，而在BYHWD和槲皮素处理组中，TNF-α的表达水平明显降低。这些实验结果支持了槲皮素在抑制炎症反应和减轻细胞损伤方面的有效性，同时也表明BYHWD在治疗CIS中的多靶点作用机制。

此外，本研究还通过功能富集分析，揭示了BYHWD作用的生物学过程和分子功能。在生物学过程（Biological Process, BP）中，主要涉及激素调节、氧化应激反应和细胞迁移调控；在细胞组分（Cellular Component, CC）中，主要与转录因子调控、RNA聚合酶II转录复合物和常染色体相关成分有关；在分子功能（Molecular Function, MF）中，主要涉及泛素样蛋白结合、DNA结合转录因子活性和蛋白激酶结合。这些分析进一步明确了BYHWD通过多种信号通路和靶点发挥治疗作用的机制。

研究还探讨了TNF信号通路在CIS中的关键作用。TNF-α作为一种重要的促炎因子，参与了多种炎症反应和神经损伤过程。通过抑制TNF-α的表达，BYHWD和槲皮素能够有效减轻炎症反应，从而保护神经元免受损伤。这一发现不仅有助于理解BYHWD的治疗机制，也为开发新的抗炎药物提供了理论依据。

尽管本研究取得了一定成果，但仍存在一些局限性。由于BYHWD是一个复杂的中药复方，其在体内给药后的药代动力学和药效学特征仍需进一步研究。此外，对其他活性成分和相关靶点的深入探讨也是未来研究的方向。通过这些研究，可以更全面地揭示BYHWD在治疗CIS中的作用机制，并为临床应用提供更坚实的科学基础。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接和体外实验验证，系统地探讨了BYHWD及其活性成分槲皮素在治疗CIS中的作用机制。结果表明，BYHWD和槲皮素能够通过抑制TNF-α表达，减轻炎症反应和细胞损伤，从而发挥神经保护作用。本研究不仅为BYHWD的临床应用提供了科学依据，也为开发基于中药的新型治疗策略提供了方法论支持。未来的研究可以进一步探索BYHWD的体内作用机制，并评估其在临床治疗中的安全性和有效性。