用于快速、无创检测鲍鱼中Hallitoid疱疹病毒（HaHV-1）的环介导等温扩增检测方法

《Aquaculture》：Loop mediated isothermal amplification assay for rapid and non-invasive detection of Hallitoid Herpesvirus (HaHV-1) in abalone

海胆疱疹病毒1型（HaHV-1）是引发海胆病毒性神经球路易体炎（AVG）的致命病原体，对全球海胆养殖业造成严重威胁。本研究开发并验证了一种基于环介导等温扩增（LAMP）的高灵敏度检测方法，通过靶向HaHV-1的p102基因设计特异性引物组合，检测限达51 copies/μL，反应时间12分钟内，且无需复杂样本纯化或昂贵设备。非侵入式采样技术（棉签和过滤纸）结合ALK PEG碱液提取法，实现了在农场环境中的快速现场检测，显著优于传统PCR技术。该方法特异性排除常见细菌和近缘病毒OsHV-1干扰，临床灵敏度为100%，可有效遏制AVG暴发，支持全球海胆产业生物安全防控。

　　### 病毒检测方法在水产养殖中的应用

随着全球水产养殖业的快速发展，病原体的传播和感染问题日益突出。特别是在牡蛎等贝类养殖领域，一种名为“Hallitoid Herpesvirus-1”（HaHV-1）的病毒引发了严重的问题，导致养殖和野生种群的大量死亡。这种病毒引起的“abalone viral ganglioneuritis”（AVG）已成为全球范围内影响牡蛎产业的重要疾病之一。HaHV-1具有较高的致死率，尤其是在感染后几天内，可导致90%以上的牡蛎死亡，这给养殖业带来了巨大的经济损失和生物安全挑战。

在面对这一问题时，科学家们开始寻求更高效、更经济的病毒检测方法，以便在养殖场进行快速诊断，从而实现有效的疾病防控。传统的检测方法，如常规聚合酶链式反应（cPCR）和实时PCR（qPCR），虽然在实验室环境中表现出色，但它们通常需要复杂的设备、专业的技术人员以及较长的处理时间，这在资源有限的养殖场并不现实。因此，研究团队开发了一种名为“loop-mediated isothermal amplification”（LAMP）的检测方法，该方法能够在较短时间内检测到极低浓度的病毒，同时具备高特异性和灵敏度。

LAMP技术是一种等温扩增方法，其原理基于DNA的恒温扩增过程，可以在不依赖复杂温度循环的条件下快速扩增特定的DNA序列。这种方法不仅能够检测到HaHV-1，还能适用于其他类型的病原体检测。在本研究中，LAMP被设计用于检测HaHV-1的特定基因序列，如p102和ORF38。通过优化引物设计和检测条件，研究团队成功开发了一种能够在12分钟内检测到51个DNA拷贝的LAMP方法，并且该方法在实验感染的牡蛎样本和水体样本中均表现出良好的效果。

为了提高检测效率和准确性，研究团队还结合了一种基于碱性聚乙二醇（ALK PEG）的提取方法。这种方法简化了DNA提取过程，避免了对复杂提取试剂盒的依赖，同时减少了LAMP反应时间。通过将样本直接放置在ALK PEG溶液中，并在室温下孵育15分钟，随后在95°C下煮沸5分钟，可以有效地释放病毒DNA，为后续的LAMP检测做好准备。这种简单的提取方法使得检测过程更加便捷，适用于资源有限的养殖场环境。

### LAMP技术的优势

LAMP技术在水产养殖领域展现出显著的优势。首先，它能够在短时间内完成检测，这对于快速响应疫情至关重要。其次，LAMP不需要昂贵的热循环仪，这降低了设备成本。此外，LAMP的检测过程相对简单，不需要复杂的操作步骤，这使得非专业人员也能轻松掌握。更重要的是，LAMP具有高灵敏度和特异性，能够检测到极低浓度的病毒，这对于早期发现和预防疾病传播具有重要意义。

在本研究中，LAMP方法被成功应用于实验感染的牡蛎样本和水体样本。通过比较LAMP与cPCR的结果，研究团队发现LAMP在临床敏感性方面达到了100%，这意味着它能够可靠地检测到所有感染样本。此外，LAMP在非侵入性样本采集和处理方面也表现出色，如使用棉签收集牡蛎的黏液样本，或通过将聚醚砜（PES）滤纸浸泡在水体中进行病毒提取。这些方法不仅减少了对牡蛎的伤害，还使得检测过程更加安全和环保。

### 非侵入性样本采集的重要性

在水产养殖中，样本采集是一个关键环节，直接关系到检测的准确性和效率。传统的样本采集方法通常需要对牡蛎进行侵入性处理，这不仅增加了动物的应激反应，还可能引入污染。因此，研究团队开发了非侵入性样本采集方法，如黏液采集和水体过滤，以提高检测的可行性。

黏液采集是一种简单且非侵入性的方法，通过将棉签轻轻擦拭牡蛎壳与足之间的区域，可以收集到足够的病毒DNA。这些样本随后被放置在ALK PEG溶液中，以释放DNA并减少干扰。而水体过滤方法则通过将PES滤纸浸泡在水体中，利用其高吸附性捕获病毒DNA。这种方法特别适用于监测水体中的病毒传播情况，因为病毒在水体中可能具有更高的浓度，尤其是在感染后期。

通过这些非侵入性方法，研究团队能够有效收集样本，同时确保检测过程的简便性和安全性。这些方法不仅适用于实验室环境，也适合在养殖场现场进行快速检测，从而实现对疾病传播的及时监控和干预。

### 结论

综上所述，HaHV-1的检测和防控对于水产养殖业至关重要。传统的检测方法虽然有效，但在资源有限的环境中存在诸多限制。而LAMP技术的引入，为这一问题提供了一种新的解决方案。通过优化引物设计和检测条件，LAMP能够在短时间内检测到极低浓度的病毒，同时保持高特异性和灵敏度。此外，结合ALK PEG提取方法，LAMP检测过程变得更加简便和高效。

这些方法的开发不仅提高了检测的准确性，还降低了成本，使得资源有限的养殖场能够进行有效的疾病监控。未来的研究可以进一步评估LAMP在不同病毒株和环境条件下的适用性，以确保其广泛应用于全球水产养殖业。通过这种快速、可靠的检测方法，养殖业能够更好地应对HaHV-1的威胁，保障牡蛎产业的可持续发展。