停流光散射技术揭示钙诱导Sorcin聚集的可逆动力学机制及其在多重耐药与神经退行性疾病中的意义

《Biochemical Journal》：Kinetic investigation of calcium-induced Sorcin aggregation by stopped-flow light scattering

本研究通过停流光散射技术系统分析了钙离子诱导的Sorcin蛋白聚集动力学，发现该聚集过程具有高度可逆性、协同性且主要受蛋白浓度调控。研究揭示了Sorcin作为细胞内钙传感器的精细调控机制，为理解其在多重耐药(MDR)和神经退行性疾病中的作用提供了新视角，建立了研究蛋白质聚集机制的新型模型系统。

　　

在癌症治疗领域，多重耐药性（MDR）一直是困扰临床疗效的重大挑战。近年来，科学家发现一种名为Sorcin的可溶性耐药相关钙结合蛋白在多种肿瘤组织中过度表达，与化疗耐药密切相关。同时，在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病患者脑组织中，Sorcin的表达水平也显著升高，提示其可能参与神经细胞保护机制。这种蛋白通过其EF-hand结构域感知细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度变化，进而调控钙稳态平衡。

然而，关于Sorcin如何精确响应钙信号并发挥其功能的分子机制尚不明确。特别是在缺乏结合伴侣的情况下，钙离子结合诱导的Sorcin构象变化是否会引发自聚集现象，以及这一过程的动力学特征和生理意义，都是亟待解答的科学问题。传统的研究方法如平板读数仪 turbidity assay由于时间分辨率有限，难以捕捉蛋白质聚集的早期快速过程，这限制了对Sorcin聚集机制的深入理解。

为了解决这些问题，西安交通大学物理学院的研究团队在《Biochemical Journal》上发表了最新研究成果。他们创新性地应用停流（stopped-flow）光散射技术，首次对钙诱导的Sorcin聚集过程进行了毫秒级分辨率的实时监测，揭示了这一过程的独特动力学特征和调控规律。

研究采用的主要技术方法包括：蛋白质表达纯化（使用pET151/D-TOPO载体在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达带6×His标签的人源Sorcin，通过Ni²⁺-NTA亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析进行纯化）、浊度测定（在384孔微孔板中使用SpectraMax iD5酶标仪监测350 nm光散射）以及停流光散射分析（使用Applied Photophysics SX20光谱仪，通过565 nm LED光源和90°角光电倍增管检测蛋白质聚集动力学）。

Ca²⁺诱导的Sorcin聚集是可逆的

研究人员首先确认了钙离子结合能够诱导Sorcin聚集，这一过程在加入钙离子螯合剂EGTA后完全逆转，表明Sorcin聚集具有高度可逆性。停流光散射技术成功捕捉到了传统方法无法分辨的快速初始聚集阶段，发现存在约0.1秒的滞后相，随后进入快速生长期。特别值得注意的是，聚集体的解聚过程与聚集过程同样迅速，均在10秒内完成，这与其他已知的不可逆蛋白质聚集体系形成鲜明对比。

蛋白质浓度对Sorcin聚集的影响

研究发现Sorcin聚集对蛋白浓度表现出高度敏感性。当Sorcin浓度从0.3 μM增加到1.3 μM时，聚集半衰期（t_1/2）从约300秒缩短至10秒，降低了约30倍。最大聚集速率（k_max）与蛋白浓度呈幂律关系，指数约为3.74，表明聚集过程涉及复杂的多步反应机制，可能包括次级成核或生长过程。聚集程度（V_m）与蛋白浓度呈线性正相关，进一步证实了浓度依赖性。

Ca²⁺浓度对Sorcin聚集的影响

与对蛋白浓度的高度敏感性相比，Sorcin聚集对钙离子浓度的响应呈现出典型的S型曲线特征，符合Hill方程，Hill系数高达9.15±0.89，表明存在极强的正协同效应。半数最大聚集对应的钙离子浓度（K_1/2）为93.7±1.10 μM，远高于生理条件下的静息钙离子水平（<1 μM），这一发现对理解Sorcin的生理功能具有重要意义。

Mg²⁺对Ca²⁺诱导的Sorcin聚集的抑制作用

生理浓度的镁离子（Mg²⁺）能够有效抑制钙诱导的Sorcin聚集。当Mg²⁺浓度超过4 mM时，聚集被显著抑制，这反映了细胞内镁离子对Sorcin活性的调节作用，可能通过竞争性结合EF-hand结构域来稳定蛋白质的非活性构象。

盐浓度对Sorcin聚集的影响

离子强度的变化显著影响Sorcin聚集行为。高盐条件（>30 mM KCl）抑制聚集，而极低盐条件（<30 mM）同样减弱聚集程度，表明静电相互作用在Sorcin自聚集过程中扮演重要角色。这种独特的盐浓度依赖性提示Sorcin聚集可能受到细胞内局部微环境的精细调控。

EF-hand突变对Sorcin聚集的影响

通过构建EF1-3结构域的点突变体（E53Q、E94A和E124A），研究人员证实这三个钙结合位点对Sorcin聚集均至关重要。任一突变都足以在基础条件下完全消除聚集现象，只有在极高钙离子浓度（最高达2 mM）下才能部分恢复聚集能力，且不同突变体表现出差异性的钙敏感性，反映了EF-hand结构域之间的协同工作机制。

研究结论与讨论部分指出，Sorcin的聚集行为与其作为细胞内钙传感器的功能密切相关。虽然生理静息钙离子浓度不足以触发Sorcin聚集，但在特定微环境（如钙通道附近的局部钙微域）中，瞬时的高钙浓度可能促进Sorcin的可逆性自聚集。这种聚集的高度可逆性区别于传统的病理性蛋白质聚集，反映了Sorcin通过构象变化动态调节其寡聚状态的生理特性。

特别重要的是，研究发现Sorcin聚集主要受其表达水平调控，而非生理钙浓度。这一发现揭示了细胞可能通过调节Sorcin表达量来精细调控其钙敏感性，为理解Sorcin在多重耐药和神经退行性疾病中的作用提供了新机制。在癌症细胞中，Sorcin的过度表达可能增强其应对化疗药物诱导钙信号的能力；而在神经退行性疾病中，上调的Sorcin可能通过调节神经元钙稳态发挥保护作用。

该研究建立的停流光散射技术为蛋白质聚集动力学研究提供了强大工具，而Sorcin体系本身因其可逆性、可调控性而成为研究蛋白质聚集机制的理想模型。这些发现不仅深化了对Sorcin生物学功能的理解，也为开发针对多重耐药和神经退行性疾病的治疗策略提供了新的思路和靶点。