基于恶性胸腔积液构建临床可转化的2.5D肺腺癌类器官平台用于精准药物筛选及肿瘤-免疫-基质建模

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：A clinically translatable 2.5D lung adenocarcinoma organoid platform derived from malignant pleural effusions for precision drug screening and tumor-immune-stromal modeling

本研究针对传统3D类器官模型成本高、技术复杂、难以模拟肿瘤免疫相互作用等局限性，开发了两种源自肺腺癌恶性胸腔积液(MPE)的新型2.5D培养系统。研究证实该模型与亲本肿瘤基因组一致性超过90%，保留了关键功能特征，并将成本降低约90%，为精准医学提供了有前景的平台。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中约60%的患者确诊时已处于晚期。肺腺癌(LUAD)作为最常见的组织学亚型，占所有肺癌病例的40%以上，其临床和生物学意义尤为突出。恶性胸腔积液(MPE)是晚期肺癌患者胸膜受侵导致的病理性液体积聚，既是诊断标志物，也是液体活检中尚未充分利用的资源。MPE中含有肿瘤细胞、基质成纤维细胞和免疫细胞等异质性细胞群体，这些细胞嵌入在自细胞外基质(ECM)和富含细胞因子的微环境中。尽管具有这种生物学丰富性，但超过70%的MPE样本在临床诊断后被丢弃，使其成为肿瘤建模的宝贵平台。

当代肺癌建模策略包括简化二维(2D)培养、患者来源异种移植(PDX)和三维(3D)类器官系统，每种方法都有其固有局限性。传统2D培养无法重现肿瘤-基质相互作用，而PDX模型经常表现出小鼠特异性微环境适应，改变人类肿瘤生物学。虽然包含ECM组件的3D类器官显示出改善的病理生理相关性，但其临床转化受到技术复杂性、商业基质成本过高以及实验室间重现性不一致的阻碍。最近分析表明，标准3D方案与亲本肿瘤的基因组一致性仅为60-85%，关键免疫微环境特征在培养过程中经常丢失。这些局限性促使了对简化、成本效益高且能保持肿瘤-免疫生态系统保真度的模型需求。

2.5D类器官范式最初在动物膀胱癌模型中概念化，将3D结构复杂性与2D培养可扩展性相结合。虽然初步应用于兽医肿瘤学和非肿瘤人类组织已证明可行性，但尚无研究系统优化用于LUAD的2.5D平台或利用MPE来源的天然微环境。现有2.5D系统依赖人工支架，干扰自细胞-基质信号传导，限制其模拟免疫相互作用的能力。

为解决这些空白，研究人员开发了两种互补的2.5D培养系统，利用MPE的内在生物成分：通过MPE来源的基质细胞分层构建无支架平台以创建仿生生态位；以及整合MPE上清液的热响应半固体基质以保存内源性细胞因子和ECM动力学。本研究旨在通过避免外源基质干扰和简化培养方案，开发高保真度和可重现的患者来源肿瘤类器官模型。

研究人员从吉林省肿瘤医院收集了19例经病理确诊的LUAD患者的MPE样本。通过消化和富集肿瘤细胞，建立了两种2.5D培养系统：无支架液体培养系统和半固体培养系统。关键技术方法包括MPE样本处理、细胞消化富集、支架细胞层制备、类器官培养条件优化、组织学染色（HE和阿尔新蓝染色）、免疫组织化学分析、全外显子测序(WES)和RNA测序(RNA-seq)、流式细胞术分析免疫细胞组成、血管形成实验以及药物敏感性测试。

研究结果显示，2.5D液体培养系统在10天内使80.00%(4/5)的样本形成肿瘤球体，而71.43%(10/14)的样本成功形成致密支架层。免疫组化分析证实2.5D类器官稳健表达腺癌标志物（Napsin A、CK7、TTF-1等），与来源肿瘤细胞高度一致。通过优化肿瘤细胞接种密度和培养基组成，发现20单位/mL的密度和50% MPE上清液比例可获得最佳类器官产量和尺寸。

基因组学分析表明，复杂结构的类器官比其肿瘤细胞前体具有更高的转录组丰度，成熟类器官（>40μm）显示出更保守的基因表达谱，与亲本细胞相关系数达0.97-0.99。RNA-seq分析证实2.5D类器官准确复制了MPE内的肿瘤细胞免疫微环境，包含巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种免疫细胞类型，相似度达94.2%±4.1%。WES数据显示类器官与亲本肿瘤的突变特征一致性达95.59-97.21%。

功能验证显示2.5D类器官保留细胞骨架完整性（Vimentin）、上皮细胞间粘附（E-cadherin）、细胞增殖（PCNA、Ki67）和凋亡（cleaved caspase-3）能力。阿尔新蓝染色证实类器官具有黏液分泌功能，阳性率8-16%。类器官表现出表型可塑性，能够在悬浮和粘附表型间转换。血管形成实验证明类器官分泌物具有促血管生成潜力，能诱导HUVEC细胞形成管腔样结构。

药物敏感性测试证实2.5D类器官在精准医疗中的应用价值。在一例90岁女性LUAD患者中，类器官保留EGFR 19del突变并发展出KRAS耐药突变，药敏测试显示对吉非替尼、奥希替尼、安罗替尼和顺铂敏感，与临床观察一致。另一例ALK融合突变患者来源类器官预测了对培美曲塞的敏感性，与CT评估结果相符。

研究结论表明，2.5D类器官平台成功克服了传统3D模型的技术和成本障碍，在保持高基因组保真度的同时，准确模拟肿瘤-免疫-基质微环境。该平台将成本降低约90%，培养时间缩短至3-10天，为精准肿瘤学提供临床可转化的工具。讨论部分强调，该技术消除了对特殊设备的依赖，更精确地反映原始肿瘤细胞的生长、发育、免疫微环境和遗传景观，为个性化治疗测试和临床研究提供了有力平台。

这项研究不仅推动了LUAD类器官生物学发展，还为将2.5D策略适应其他恶性肿瘤提供了蓝图，最终弥合了实验模型与临床应用之间的差距。未来研究可进一步优化低细胞数样本方案，并通过单细胞RNA-seq深入探索基质-免疫串扰机制。