综述：分裂CRISPR/Cas系统：应对分子诊断挑战的开创性解决方案

《Biosensors and Bioelectronics》：Split CRISPR/Cas systems: Pioneering solutions for molecular diagnostics challenges

本综述推荐分裂CRISPR/Cas系统作为分子诊断领域的革命性工具，其通过“分裂激活”（split-activation）策略（如分裂激活子介导的Cas系统和分裂crRNA架构），有效解决了传统CRISPR方法灵敏度低（飞摩尔级）、特异性差及需要预扩增等问题，在无扩增核酸检测、临床即时监测（POCT）和精准医疗中展现出巨大潜力。

　　

^分裂激活策略引领分子诊断革新

Cas enzymes employed in molecular diagnostics

CRISPR/Cas系统源于细菌的适应性免疫防御机制，其可编程性和特异性靶向核酸序列的能力，使其在过去十年中成为分子诊断领域的关键工具。诸如Cas12、Cas13和Cas14等系统，因其高特异性、灵敏度及快速响应时间而备受青睐。然而，传统的CRISPR检测方法，例如SHERLOCK、DETECTR和HOLMES，面临着对低丰度靶标灵敏度不足、特异性有限、调控灵活性差以及通常需要预扩增步骤等挑战。这些限制可能导致非特异性扩增、检测时间延长以及实际应用复杂性增加，从而影响反应的最佳性能。

“Split-activation” strategies for developing innovative detection systems

为应对上述挑战，分裂CRISPR/Cas系统应运而生，其核心在于“分裂激活”策略。该策略无需预扩增步骤，具备操作简单、灵活性强和检测快速等优势。在此策略中，激活DNA或CRISPR RNA（crRNA）被分割成两个独立的部分，它们能够与Cas酶组装形成有功能的Cas核糖核蛋白复合体，从而实现对RNA或DNA靶标的精确识别。本部分将深入探讨两种关键方法：其一是分裂激活子介导的Cas系统，用于实现超灵敏的RNA检测；其二是分裂crRNA架构，旨在实现多重核酸检测。这些创新机制显著提升了信号输入的多样性和活性调控的精确度。

分裂激活子介导的Cas系统

该策略通过将激活序列分割设计，使得只有当两个片段同时与靶标结合时，才能重新组装成完整的激活子，进而激活Cas酶（如Cas12a、Cas13a）的反式切割活性。这种“与门”逻辑设计极大地降低了背景噪音，实现了对低至飞摩尔（femtromolar, fM）水平生物标志物的超高灵敏度检测，同时保持了卓越的单碱基分辨能力。该系统特别适用于复杂生物样本中低丰度核酸标志物的直接检测，为肿瘤早期诊断、病原体快速筛查提供了新途径。

分裂crRNA架构

分裂crRNA策略则将负责靶标识别的crRNA序列进行分割。在无靶标存在时，分裂的crRNA片段无法有效引导Cas酶。当特定的靶标核酸存在时，它能作为模板介导两个crRNA片段发生连接或临近效应，从而重构出具有完整功能的crRNA，激活Cas酶。这种方法不仅提高了检测的特异性，还为实现多重检测（即同时检测多个靶标）提供了强大的可编程平台，在病原体分型、基因分型等领域应用前景广阔。

Advantages of split CRISPR/Cas systems

分裂CRISPR/Cas系统代表了核酸检测技术的一次重要范式转变。其核心优势在于显著提升了检测的特异性和灵敏度。传统方法难以区分高度同源的序列，而分裂激活策略通过分解识别元件，引入了额外的验证步骤，有效避免了脱靶效应。在灵敏度方面，这些系统通过减少背景信号和放大靶标依赖性信号，实现了对极低浓度靶分子的检测，甚至在某些情况下无需预扩增。此外，该策略还增强了检测系统的可编程性和调控灵活性，为构建复杂的逻辑门控检测电路奠定了基础。这些进步使得分裂CRISPR/Cas系统在即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）和资源有限环境中展现出巨大的应用潜力。

当前挑战与未来展望

尽管分裂CRISPR/Cas系统取得了显著进展，但仍面临一些挑战，包括系统背景噪音的进一步降低、多重检测能力的扩展以及成本效益的优化。未来的研究方向可能包括开发定制化的Cas蛋白变体以提升性能、结合纳米材料开发无扩增的信号放大工作流程，以及将整个检测系统集成到微流控平台中，实现自动化、一体化的分子诊断。这项技术有望为精准医疗，特别是在资源有限地区，提供强大的工具。