建立并应用一种新型罗非鱼头肾细胞系（THK-03）作为体外水生毒理学模型：评估重金属的免疫毒性和病毒反应

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Establishment and application of a novel tilapia head kidney cell line (THK-03) as an in vitro aquatic toxicology model: Evaluating heavy metal immunotoxicity and virus responses

尼罗 tilapia 头肾来源的 THK-03 细胞系建立及功能分析。通过原代培养和连续传代获得稳定增殖的 THK-03 细胞系，经 18S rRNA 鉴定确认其来源于尼罗 tilapia 头肾组织。该细胞系对 LPS、LTA 和 poly(I:C) 激酶反应显著，激活 MyD88 和 TRIF 信号通路，上调 IL-1β、TNFα 等炎症因子及 Irf3、Isg15 等干扰素相关基因。在重金属毒性实验中， Cr 显示最高细胞毒性， Zn 唯一上调抗炎 IL-10 表达。病毒学分析证实 THK-03 可支持新加坡鲈鱼 iridovirus (SGIV) 有效复制，产生病毒颗粒并引发细胞病理效应。该细胞系为研究鱼类免疫-毒性互作及宿主-病原互作机制提供了可靠平台。

　　本文主要探讨了从尼罗罗非鱼（*Oreochromis niloticus*）头肾中建立的一种连续细胞系THK-03，用于研究其在环境毒理学和病毒致病机制中的应用潜力。头肾作为鱼类的免疫器官，是研究免疫反应和毒理效应的重要资源。THK-03细胞系在特定培养条件下表现出良好的增殖能力，同时保持了上皮样细胞的形态特征，这使得它在模拟鱼类免疫反应和环境毒素影响方面具有独特的价值。

### 一、研究背景与意义

尼罗罗非鱼作为全球淡水养殖业中具有重要经济价值的物种，其免疫系统的强健性与环境适应能力为养殖业提供了重要的支持。然而，随着环境恶化和病原体致病机制的演变，尼罗罗非鱼养殖过程中仍面临诸多挑战，如链球菌病和多种病毒病的爆发，给养殖业带来了严重的经济损失。同时，养殖水体中重金属污染问题日益严重，不仅影响鱼类健康，还可能通过生物富集和生物放大效应威胁生态系统的安全以及食品安全。因此，深入研究尼罗罗非鱼的免疫系统及其对病原体和重金属胁迫的反应，对于理解其免疫调节机制和疾病抵抗力具有重要意义。

### 二、THK-03细胞系的建立与特性

研究人员从尼罗罗非鱼头肾组织中分离出THK-03细胞系，并对其生物学特性进行了系统评估。该细胞系在L-15培养基中能稳定增殖，并且在25°C的条件下维持上皮样细胞形态超过100代。通过18S rRNA基因测序和高转染效率验证，确认了THK-03的来源和功能可靠性。THK-03细胞在不同病原体相关分子模式（PAMPs）刺激下表现出不同的免疫反应。例如，LPS（脂多糖）能够激活MyD88和TRIF两条信号通路，LTA（脂蛋白）则通过TLR2-MyD88信号通路引发炎症反应，而poly(I:C)则能够诱导抗病毒状态。这些结果表明，THK-03细胞系在免疫研究中具有广泛的适用性。

此外，THK-03细胞系在重金属暴露实验中表现出显著的毒性反应。其中，铬（Cr）显示出最高的细胞毒性，而锌（Zn）则能够显著上调抗炎因子IL-10的表达。这些发现为理解重金属对鱼类免疫系统的潜在影响提供了新的视角。同时，THK-03细胞支持新加坡石斑鱼虹疱病毒（SGIV）的增殖，表现出明显的细胞病变效应（CPE）和病毒颗粒形成，这使其成为研究鱼类抗病毒免疫和病毒-宿主相互作用的理想模型。

### 三、细胞系的培养条件与稳定性

为了优化THK-03细胞的生长条件，研究人员对其在不同培养基、温度和胎牛血清（FBS）浓度下的生长情况进行了评估。结果显示，THK-03细胞在L-15培养基中生长最为理想，而在DMEM、M199和MEM等其他培养基中则表现出较弱的生长能力。此外，THK-03细胞在18–32°C的温度范围内均能有效增殖，但在39°C时生长完全受到抑制。这表明，L-15培养基和25°C的培养条件是THK-03细胞系最适宜的环境。

关于FBS浓度的影响，研究发现5%的FBS显著抑制了细胞的生长，而10–20%的FBS则能够支持细胞的正常增殖。这些实验结果为THK-03细胞系的长期培养提供了重要的参考，有助于确保其在实验室环境下的稳定性和可重复性。

### 四、细胞系的冻存与复苏

THK-03细胞系在冻存过程中表现出良好的细胞存活率。研究人员每隔5代对细胞进行冻存，冻存后的细胞复苏显示其形态未发生明显变化，且细胞活力维持在较高水平。通过台盼蓝染色法检测，仅有一小部分细胞膜完整性受损，而大多数细胞仍保持活力。这表明THK-03细胞系具有较强的耐受性和稳定性，能够作为长期保存的细胞资源，为后续实验提供可靠的材料。

### 五、细胞系的染色体分析

THK-03细胞系在第90代时进行了染色体分析。结果显示，其染色体数目在6至68之间波动，但具有特征性染色体数目为40（2n）。这一结果表明，THK-03细胞系在遗传学上具有一定的稳定性，为研究其基因表达和功能提供了基础。

### 六、转染效率的评估

为了验证THK-03细胞系是否适用于基因功能研究，研究人员通过转染pEGFP-N1质粒评估其转染效率。结果表明，THK-03细胞系的转染效率超过30%，说明其具备良好的基因转染能力，适用于研究外源基因的表达及其功能影响。

### 七、THK-03细胞对PAMPs的反应

THK-03细胞对不同的PAMPs表现出不同的反应模式。LPS刺激后，促炎因子IL-1β和TNFα的表达显著上升，而抗炎因子IL-10和TGFβ则表现出先下降后上升的趋势，这可能反映了细胞在面对病原体时的调节机制。此外，LPS激活了MyD88和TRIF两条信号通路，其中MyD88的表达持续上升，而TRIF的表达则在6小时后短暂上升。这些结果表明，THK-03细胞能够有效响应LPS刺激，并通过不同的信号通路调控免疫反应。

相比之下，LTA（脂多糖类似物）刺激主要激活TLR2-MyD88信号通路，导致IL-1β和TNFα的显著上调，而其他信号通路因子如P38和P65则未发生明显变化。这表明，LTA主要通过TLR2激活免疫反应，而其他通路可能未被显著激活。此外，poly(I:C)刺激显著上调了TLR3和Isg15的表达，说明THK-03细胞对RNA病毒的免疫反应较为敏感，并可能通过TLR3-TRIF和TLR3-MyD88等通路发挥抗病毒作用。

### 八、THK-03细胞对重金属的反应

重金属污染是当前水产养殖面临的重要问题，其对鱼类细胞的毒性作用可能导致细胞损伤、免疫抑制和氧化应激。THK-03细胞系在不同浓度的重金属（如铜、铬、锌和锰）暴露下表现出显著的细胞毒性反应。其中，铬的毒性最强，导致细胞数量减少、细胞膜受损和细胞内容物泄漏，而铜则表现出类似的但较弱的毒性。锌和锰虽然毒性较低，但仍对细胞的正常形态产生一定影响。

基因表达分析进一步揭示了THK-03细胞对重金属暴露的反应机制。例如，铬和铜能够显著上调促炎因子和抗氧化基因的表达，这可能与其引发的免疫反应和氧化应激有关。而锌则表现出较强的抗炎作用，上调IL-10的表达，这可能有助于调节免疫反应并减少炎症反应的过度激活。这些结果为理解重金属对鱼类免疫系统的潜在影响提供了重要的线索。

### 九、THK-03细胞对SGIV的反应

SGIV是一种属于虹疱病毒科的病毒，能够感染多种高价值的海水鱼类，如石斑鱼。THK-03细胞系在SGIV感染后表现出明显的细胞病变效应，包括细胞缩小、细胞质延长和细胞边缘出现不规则的突起。这些变化进一步验证了THK-03细胞对SGIV的敏感性。通过透射电镜（TEM）观察，研究人员在感染细胞的细胞质空泡中检测到大量SGIV病毒颗粒，这表明THK-03细胞能够支持病毒的增殖。

此外，SGIV感染显著上调了相关免疫基因的表达，如IL-1β、TNFα、Tbk1、Traf3、Traf6、Irf3和Isg15。这些基因的上调可能与病毒诱导的免疫反应和抗病毒状态有关。这些结果表明，THK-03细胞系能够有效模拟病毒与宿主之间的相互作用，为研究鱼类抗病毒免疫提供了新的工具。

### 十、研究意义与展望

THK-03细胞系的建立为鱼类免疫学、毒理学和病毒学研究提供了新的平台。该细胞系在不同环境刺激下表现出多样化的反应模式，使其成为研究鱼类免疫调节机制和病原体致病过程的理想模型。此外，THK-03细胞系在重金属暴露下的反应模式为理解重金属对鱼类免疫系统的潜在影响提供了新的视角，有助于开发有效的污染防控策略。

THK-03细胞系的广泛应用前景广阔，不仅可用于研究鱼类免疫系统的基本功能，还可以用于评估环境污染物对鱼类健康的影响，以及探索病毒与宿主之间的相互作用机制。随着细胞培养技术的不断进步，THK-03细胞系有望成为鱼类免疫和毒理研究中的重要工具，为推动水产养殖业的可持续发展提供科学依据。