利用长链RNA片段的降解比率来估算血迹沉积后经过的时间

《Food Wellness》：Using long RNA fragment degradation ratio to estimate the time elapsed since bloodstain deposition

本研究利用KOD DNA聚合酶扩增长RNA片段，通过计算1782:51、998:51和578:51降解比率，成功估算室温保存血渍的沉积时间（1-6个月），并发现湿血渍RNA降解迅速。

　　

中西宏明|高田彩|米山勝美|酒井健太郎|斋藤和之

日本东京文京区本乡2-1-1 顺天堂大学医学院法医学系，邮编113-8421

摘要

在调查涉及伤害或死亡的犯罪时，有时需要估算血迹在犯罪现场形成后的时间长度。基于血迹中RNA降解程度的方法是最常用的指标之一，但通用实时聚合酶链反应（PCR）技术在此方面的应用常常受到限制，因为这些技术无法量化长度超过400个碱基对（bp）的DNA片段，因此不适用于相对较新的血迹。我们使用能够扩增长度超过500个bp的RNA片段的实时PCR方法来评估这些比率在估算相对较新血迹年龄方面的潜力。血迹被存储在室温（RT）下或冰箱中，时间不超过6个月；那些在储存1天后被水浸湿的血迹随后在室温下继续储存不超过7天。我们使用Kodakaraensis（KOD）DNA聚合酶扩增了ACTB基因中的51、578、998和1782个bp的片段，并计算了578:51、998:51和1782:51的片段比率作为RNA降解比率。我们的方法成功地使用KOD DNA聚合酶量化了长度在500至1800个bp之间的长片段。所有干血迹的片段比率都与血迹形成后的时间长度有很好的相关性；特别是1782:51（储存时间≤1个月）、998:51（≤2个月）和578:51（≤6个月）的比率适用于估算血迹形成时间。而在一些储存时间超过10天的样本中，未能检测到冰箱中储存的血迹的578、998和1782个bp片段。结果表明，血迹在被浸湿后RNA会迅速降解，随后逐渐进一步降解。我们的研究结果表明，可以使用上述三种RNA片段长度作为指标，来估算室内储存的干血迹形成后的时间（最长6个月）。

引言

在调查涉及伤害或死亡的犯罪时，有时需要估算血迹在犯罪现场形成后的时间长度。这类估算对于确定（i）血迹样本是否与犯罪相关，以及（ii）血液沉积的大致时间点非常重要，后者反映了犯罪发生的时间。已经有多种方法用于估算血液和其他体液沉积后的时间长度，其中基于样本RNA（如信使RNA、微RNA或环状RNA）降解程度的方法是最常用的指标之一[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。RNA降解程度通常通过实时聚合酶链反应（PCR）方法进行测量，该方法通过计算长片段与短片段的比率[1]、[2]或评估RNA标记物的稳定性差异[1]、[3]、[4]、[5]、[6]来实现。然而，通用实时PCR技术往往受到无法量化长度超过400个bp的DNA片段的限制，因此不适用于相对较新的血迹。实际上，在之前的研究中，RNA降解程度通常是按周或按月进行测量的。

用于估算血迹沉积后较短时间长度的方法包括通过原子力显微镜[7]、高效液相色谱[8]、[9]或反射光谱[10]、[11]、[12]观察血红蛋白衍生物的变化。然而，除了少数研究外，这些方法都比较陈旧，且技术尚未更新。一些方法使用核酸，但由于DNA稳定性较好，因此很少有方法专门针对DNA降解。为了基于DNA降解程度估算血迹沉积后的较短时间，需要测量至少10,000个碱基对（bp）的DNA片段[13]，这可能并不现实。因此，需要一种基于RNA降解而非DNA测量的方法来估算血迹沉积后的较短时间。

Kodakaraensis（KOD）DNA聚合酶是一种来自嗜热古菌Thermococcus kodakarensi的高保真耐热酶[14]，即使在实时PCR中也能扩增长度约为2000个bp的DNA片段[15]。我们推测，使用KOD DNA聚合酶量化长度超过500个bp的长RNA片段可能有助于确定血迹沉积后的较短时间（即几天到1-2周）。因此，我们进行了本研究，尝试使用这种聚合酶通过实时PCR来测量RNA降解比率，以估算相对较新的血迹的沉积时间。

样本制备

样本制备

从六名提供书面知情同意的成年志愿者捐赠者处收集血液样本。每个血迹样本是通过将捐赠者的血液滴在棉纱上，在室温（RT）下干燥1天后制成的，然后分别在不密封的情况下在室温（使用六名捐赠者的血迹；第一组）或冰箱中（也使用六名捐赠者的血迹）储存最多6个月。本研究中使用的冰箱是医药用冰箱（MPR-S300H-PJ）。

结果

图1展示了第一组在室温下储存的干血迹的ΔCt值变化与血迹沉积后经过的时间长度之间的关系。所有三种RNA片段比率都与血迹沉积后的时间长度有很好的相关性。值得注意的是，以下RNA片段比率适用于估算血迹沉积时间：1782:51比率（R2=0.8653），998:51比率

血迹沉积时间的估算

我们通过计算各种长RNA片段的比率来估算血迹沉积后的较短时间。使用KOD DNA聚合酶成功量化了长片段，而这种方法在法医RNA降解研究中并不常用。

对于干血迹样本，我们检查的所有三种片段比率都与血迹沉积后的时间长度有很好的相关性。其中，以下比率特别适用于估算

结论

我们的研究结果表明，可以使用室内储存的干血迹中的三种长RNA片段长度作为指标，来估算血迹沉积后的时间（最长6个月）。然而，由于犯罪现场条件的多样性，本研究的结果不能普遍适用于法医实践。将这种方法应用于法医实践需要在相同的环境条件下进行测试。

作者贡献声明

中西宏明：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、方法设计、实验设计、数据分析、数据管理、概念构建。高田彩：撰写 – 审稿与编辑。斋藤和之：撰写 – 审稿与编辑、资金获取。米山胜美：撰写 – 审稿与编辑。酒井健太郎：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

我没有任何需要声明的利益冲突。