组织蛋白酶L通过调控HGF激活因子促进非小细胞肺癌干细胞特性及多药耐药的新机制

《Molecular and Cellular Biochemistry》：The lysosomal cysteine protease cathepsin L promotes stemness and multidrug resistance of non-small cell lung cancer by targeting HGF activator

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)化疗多药耐药(MDR)难题，揭示了组织蛋白酶L(CTSL)通过转录调控HGF激活因子(HGFAC)激活HGF/Met信号通路，进而促进肺癌干细胞(LCSCs)自我更新和耐药性的新机制。研究人员通过肿瘤球体模型、基因干预和动物实验证实CTSL抑制剂联合多西他赛可显著逆转耐药，为克服NSCLC化疗耐药提供了新的靶向治疗策略。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占比超过80%。尽管化疗是晚期NSCLC的主要治疗手段，但多药耐药(MDR)导致的治疗失败成为临床面临的严峻挑战。近年来研究发现，肺癌干细胞(LCSCs)在MDR形成中发挥关键作用，这群具有自我更新和分化能力的细胞可通过高表达药物外排泵、激活DNA修复通路等机制抵抗化疗药物攻击。然而，调控LCSCs特性维持和耐药性的具体分子机制尚未完全阐明。

在这项发表于《Molecular and Cellular Biochemistry》的研究中，史慧、徐建宇等研究人员聚焦于组织蛋白酶L(CTSL)这一溶酶体半胱氨酸蛋白酶在NSCLC干细胞特性维持和MDR中的作用机制。研究人员通过生物信息学分析发现，CTSL在NSCLC组织中高表达且与患者不良预后显著相关。为验证这一发现，团队采用肿瘤球体培养技术模拟LCSCs特性，发现球体细胞不仅高表达干细胞标志物CD133、CD44和干性维持因子OCT4、SOX2，还对六种常用化疗药物（紫杉醇、多西他赛、培美曲塞、吉西他滨、卡铂、顺铂）表现出显著耐药性，其中对多西他赛的耐药指数最高达83.25倍。

机制探索方面，研究团队通过RNA测序(RNA-seq)技术发现CTSL过表达可显著上调HGF激活因子(HGFAC)的转录水平。染色质免疫沉淀(ChIP-qPCR)实验进一步证实CTSL可直接结合HGFAC启动子区域，表明CTSL具有转录调控功能。ELISA检测显示CTSL过表达细胞中HGFAC和HGF分泌水平显著升高，同时Met受体酪氨酸磷酸化(p-Met)水平增强，提示CTSL-HGFAC-HGF-Met信号轴的存在。

功能验证实验中，研究人员使用CTSL特异性抑制剂Z-FY-CHO或siRNA干扰技术抑制CTSL表达后，肿瘤球体形成能力显著降低，干细胞标志物表达下降，同时细胞对化疗药物的敏感性显著提高。特别是联合使用CTSL抑制剂和多西他赛的治疗方案，在裸鼠移植瘤模型中表现出协同抑瘤效果，肿瘤体积和重量均显著减小。

研究采用的关键技术包括肿瘤球体培养、CCK-8细胞活力检测、Western blot蛋白印迹、qRT-PCR定量分析、RNA-seq转录组测序、染色质免疫沉淀、ELISA检测及裸鼠异种移植瘤模型等。所有细胞系均来自中国科学院典型培养物保藏委员会，实验方案经苏州大学伦理委员会批准(SUDA20250828A07)。

Spheroid culturation is associated with enhanced stemness and MDR in NSCLC cells

通过肿瘤球体培养技术成功获得具有干细胞特性的A549-Sp和H1299-Sp细胞，这些细胞高表达CD133、CD44、OCT4和SOX2等干细胞标志物，并对多种化疗药物表现出显著耐药性，其中对多西他赛的耐药性最为突出。

Elevated CTSL levels are positively associated with chemotherapy resistance and tumor progression in patients with NSCLC

生物信息学分析显示CTSL在NSCLC组织中高表达与患者不良预后相关。实验验证发现球体细胞中CTSL在mRNA和蛋白水平均显著上调，表明CTSL与NSCLC干细胞特性和化疗耐药密切相关。

Suppression of CTSL reduces MDR in NSCLC spheroid cells

CTSL基因沉默或药理抑制可显著增强球体细胞对化疗药物的敏感性，降低多药耐药蛋白MDR1和ABCG2的表达。动物实验证实CTSL抑制剂与多西他赛联用可协同抑制肿瘤生长。

CTSL enhances stemness and survival in NSCLC spheroid cells

CTSL抑制可降低肿瘤球体形成能力，下调干性因子OCT4/SOX2表达，减少抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2水平，而CTSL过表达则产生相反效果，表明CTSL在维持干细胞特性和细胞存活中起关键作用。

The HGFAC-mediated HGF/Met axis is a potential downstream target of CTSL in NSCLC cells

RNA-seq和ChIP-qPCR证实CTSL可直接转录调控HGFAC表达，进而激活HGF/Met信号通路。功能挽救实验表明外源HGF可部分恢复CTSL缺失细胞的耐药表型，Met磷酸化抑制剂capmatinib可逆转CTSL介导的化疗耐药。

本研究系统阐明了CTSL通过转录调控HGFAC表达，激活HGF/Met信号通路，进而促进NSCLC干细胞特性维持和多药耐药的新机制。这一发现不仅深化了对肺癌干细胞耐药机制的理解，更重要的是为克服NSCLC化疗耐药提供了新的治疗靶点。CTSL抑制剂与常规化疗药物联合使用的策略，有望成为逆转NSCLC多药耐药的有效手段，具有重要的临床转化价值。尽管研究在机制探索方面取得了显著进展，但CTSL转录调控功能是否依赖其蛋白酶活性、以及该策略的临床安全性等问题仍需进一步研究。总体而言，该研究为开发针对癌症干细胞特性的新型靶向疗法奠定了坚实的理论基础。