基于HP-β-CD和聚山梨酯的rhNELL-1蛋白制剂开发：一种消除外源性应激诱导聚集的四阶段策略

《AAPS Open》：A four-stage process that identified a hydroxypropyl beta cyclodextrin and polysorbate containing formulation that eliminated aggregation of recombinant human NELL-1 after exposure to extrinsic stresses

本研究针对重组人NELL-1蛋白在生产和储存过程中易发生聚集的问题，通过四阶段系统化制剂开发策略，成功筛选出含有羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和聚山梨酯20(PS20)的稳定液体制剂。研究显示PS20有效抑制界面应力诱导的聚集，而HP-β-CD显著增强溶液相稳定性，特别是在高温条件下。该研究为其他易聚集蛋白的制剂开发提供了系统性框架。

　　

在再生医学领域，重组人NELL-1(rhNELL-1)作为一种具有强大成骨活性的蛋白质，展现出治疗骨缺损和促进组织再生的巨大潜力。然而，这种高分-子量蛋白质(还原条件下130 kDa，非还原条件下超过420 kDa)在实际应用中面临严峻挑战——它极易发生聚集，这会影响其疗效和安全性。蛋白质聚集问题贯穿于整个药物开发流程：从生产纯化到灌装储存，再到临床使用，外源性应力如机械振荡、冻融循环、温度变化等都可能导致蛋白质发生不可逆的聚集。

传统制剂开发往往依赖试错法，效率低下且难以系统解决复杂的蛋白质稳定性问题。正是针对这一瓶颈，Lun Xin团队在《AAPS Open》上报道了一种创新的四阶段理性制剂开发策略，成功解决了rhNELL-1的聚集难题。他们不仅开发出了稳定的液体制剂，更重要的是建立了一套可推广至其他易聚集蛋白的系统性开发框架。

研究团队采用了一系列关键技术方法：通过差示扫描荧光法(DSF)和等温化学变性(ICD)评估构象稳定性；利用聚乙二醇挑战实验和动态光散射(DLS)分析胶体稳定性；采用微流成像(MFI)和超高效尺寸排阻色谱(UP-SEC)检测可见和亚可见颗粒；并通过实验设计(DoE)方法系统优化制剂组成。

Stage 1：NELL-1物理不稳定性的内在因素

研究人员首先深入探究了导致rhNELL-1不稳定的内在因素。构象稳定性分析显示，rhNELL-1的第一熔解温度约为59.0±2.0°C，明显低于典型的免疫球蛋白G1(IgG1)的62.0-74.0°C，表明其构象灵活性较高。ICD分析进一步证实，rhNELL-1在低浓度变性剂(0.46-0.87 M GDN-HCl)下就发生初步去折叠，提示其易于暴露疏水残基。

胶体稳定性研究表明，在pH 7.4条件下，rhNELL-1表现出负的扩散相互作用参数(k_D)，表明蛋白质分子间存在净吸引相互作用，这是胶体稳定性差的重要标志。结构分析揭示了更多细节：rhNELL-1表面存在多个疏水区域，其中一段长的α-螺旋段被鉴定为高聚集风险区域。此外，蛋白质的偶极矩计算值为4.37×10^-12 D，表明电荷分布不对称，这可能进一步促进蛋白质自关联。

Stage 2：通过响应曲面DoE优化制剂

基于第一阶段的认识，研究团队设计了理性的制剂策略。他们通过实验设计(DoE)系统评估了缓冲液类型(Tris-HCl vs. 磷酸钾)、离子强度(KCl浓度)、山梨醇浓度(3-6%)、聚山梨酯类型(PS20 vs. PS80)和HP-β-CD类型等多个参数的相互作用。

预实验发现，HPB-LB-BCD(一种HP-β-CD)与PS20的组合在PEG挑战实验中表现出最低的浊度，表明最佳的胶体稳定性。DSF分析显示所有筛选的制剂对rhNELL-1的熔解温度影响不大，说明辅料不影响蛋白质的整体折叠结构。

响应曲面分析揭示了各参数间的复杂相互作用。研究发现，磷酸钾缓冲液(KPH)在构象和胶体稳定性方面均优于Tris-HCl缓冲液。山梨醇浓度与构象稳定性正相关，而HP-β-CD则主要改善胶体稳定性。最终确定的最佳制剂组成为：KPH缓冲液(pH 7.4)、无KCl、6%山梨醇、75 mM HPB-LB-BCD和0.025% PS20。

Stage 3：通过缩小规模振荡研究评估制剂

在第三阶段，研究人员测试了10种候选制剂在剧烈振荡应激下的表现。结果明确显示，含有PS20的制剂(DP-F4、DP-F5、DP-F9、DP-F10)在24小时振荡后均未产生可见颗粒，且亚可见颗粒数量显著降低。而不含PS20的制剂则表现出大量颗粒形成。

特别值得注意的是，在已经含有PS20的制剂中添加HPB-LB-BCD(如DP-F4 vs. DP-F5)并未进一步减少颗粒形成，这与两种辅料的作用机制一致：PS20主要抑制界面应力导致的聚集，而HP-β-CD则在溶液相中发挥作用。

Stage 4：领先制剂在三种外源性应激下的评估

最后阶段对筛选出的四种领先制剂(DP-F1、DP-F4、DP-F9、DP-F10)进行了更全面的应激测试，包括冻融循环、振荡和不同温度下的长期储存。

结果发现，在5次冻融循环和3天振荡后，含有PS20的制剂(DP-F4、DP-F9、DP-F10)均保持了较低的亚可见颗粒水平，而不含PS20的DP-F1则表现出显著的颗粒形成。温度稳定性研究出现了意想不到的结果：在5°C储存一个月后，所有制剂都出现了亚可见颗粒增加的现象，这可能与冷诱导的相分离有关。

在40°C加速稳定性研究中，所有制剂均表现出显著的蛋白质降解，但含有HPB-LB-BCD和PS20的DP-F4和DP-F9表现最佳，显示出较低的高分子量(HMW)物种形成。SEC分析进一步证实，DP-F4和DP-F9在高温条件下能更好地维持蛋白质的单体形式。

研究结论与意义

本研究成功开发了一套四阶段理性制剂开发策略，有效解决了rhNELL-1的聚集问题。两种领先制剂(含有磷酸钾/Tris缓冲液、山梨醇、PS20和HPB-LB-BCD)在多种外源性应激条件下均表现出优异的抗聚集性能。

机制上，PS20和HPB-LB-BCD展现出互补的保护作用：PS20有效抑制界面应力导致的聚集，而HPB-LB-BCD则通过屏蔽疏水相互作用增强溶液相中的胶体稳定性。特别是在高温条件下，HPB-LB-BCD的添加显著改善了蛋白质的稳定性。

这项研究的创新性不仅在于成功稳定了一个具有挑战性的大分子量蛋白质，更重要的是建立了一套系统性的制剂开发框架。该框架结合了蛋白质内在特性分析、理性辅料选择、系统化制剂优化和全面应激测试，可推广至其他易聚集治疗性蛋白质的制剂开发。

最终选择的制剂(DP-F9：10 mM Tris-HCl pH 7.4、6%山梨醇、0.05% PS20、125 mM HPB-LB-BCD)既考虑了稳定性需求，也兼顾了生产工艺的便利性，因为纯化步骤中使用的正是Tris-HCl缓冲液，这可最大限度减少缓冲液交换对蛋白质质量的影响。

这项工作为生物制药行业提供了宝贵的见解和方法学参考，特别是在处理具有复杂结构特征和聚集倾向的蛋白质 therapeutics 时，展现了一条从分子理解到实用制剂开发的清晰路径。随着再生医学领域的不断发展，对这类高效但稳定性差的生物大分子的成功制剂开发将变得越来越重要。