猕猴桃作为重要的经济果树，全球种植正面临细菌性溃疡病(bacterial canker, BC)的严重威胁。这场"猕猴桃癌症"的元凶是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)，其中生物型3(Psa3)尤为致命，自2010年起在新西兰暴发后迅速蔓延至全球主要产区，导致叶片坏死、芽脱落、果实萎蔫和藤蔓枯死等毁灭性症状。尽管防控措施不断升级，Psa3仍持续威胁着猕猴桃产业，不同品种对其抗性存在显著差异，如'红阳'高度感病而'白果'表现抗病。传统基因编辑手段如SacB介导的同源重组技术耗时且易出现假阳性，严重制约了病原体效应蛋白功能研究。而在植物与病原体这场永恒的"军备竞赛"中，效应蛋白作为病原体的关键武器，既能抑制植物基础免疫(PTI)，又可能被植物抗病(R)蛋白识别触发超敏反应(HR)。Psa3特有的hopZ5和hopH1效应蛋白共同转录，可能在其致病机制和寄主特异性中扮演重要角色。然而，由于缺乏高效的基因编辑工具，这些效应蛋白在猕猴桃-Psa互作中的具体功能一直难以解析。针对这一技术瓶颈，上海交通大学农业与生物学院陈功友教授团队在《Molecular Horticulture》发表了创新性研究。他们成功将CRISPR/FnCas12a基因组编辑系统应用于Psa，建立了高效、可迭代的基因敲除技术体系，并利用该平台揭示了hopH1和hopZ5在病原体致病性和寄主特异性中的双重功能。关键技术方法主要包括：采用双亲接合转化法将CRISPR/FnCas12a系统导入Psa M228菌株；构建含异源NHEJ修复蛋白Ku和LigD的编辑载体提升敲除效率；设计特异性crRNA靶向hopH1和hopZ5基因位点；通过诱导型四环素启动子调控FnCas12a表达以降低细胞毒性；利用pML-B3free系统进行质粒清除实现连续基因编辑；通过叶片圆片接种法和细菌数量统计分析突变体致病性；采用荧光素酶互补 assay(LCA)检测蛋白互作。Development of a CRISPR/FnCas12 editing system in Psa with heterologous NHEJ proteins研究人员首先构建了适用于Psa的广宿主载体pBBR1-MCS2，将FnCas12a模块与靶向hopH1的crRNA组装成功。实验发现，不含Ku和LigD的pHZB3系统无法获得有效突变体，而引入这两个NHEJ修复蛋白的pHZB4系统成功实现了基因编辑，证明外源NHEJ系统对修复FnCas12a诱导的双链断裂至关重要。
Generation of hopH1-deleted mutants with CRISPR/FnCas12a研究设计了两种靶向hopH1不同位点的crRNA，通过双亲接合将编辑系统导入Psa。创新性地采用两对引物同时检测基因组删除和质粒存在状态，从624个转化子中鉴定出5种基因型。其中II型(2.72%)同时具有小于2074bp的删除条带和576bp的质粒条带，为有效突变体。测序证实10个突变体存在86-972bp不等的删除，删除范围覆盖PAM序列两侧，且无方向偏好性。
Characterization of edited Psa mutants对17个II型突变体的测序分析显示，crRNA1(靶向hopH1中部)产生6个突变体，删除范围369-664bp；crRNA2(靶向5'端)产生4个突变体，删除范围86-972bp。突变体#3实现了hopZ5和hopH1的双基因删除。通过pML-B3free系统成功清除编辑质粒，获得无质粒的△hopH1突变体，为后续迭代编辑奠定基础。
Generation of hopH1-hopZ5 double mutants in Psa with CRISPR/FnCas12a在△hopH1背景下进行hopZ5敲除，从190个转化子中获得8个有效突变体(效率4.21%)。7个测序验证的突变体显示78-700bp的删除，成功构建了△hopZ5△hopH1双突变体，证明CRISPR/FnCas12a系统在已编辑菌株中仍可进行迭代基因敲除。
Virulence analysis of edited mutants致病性分析显示，在感病品种'红阳'上，△hopH1和△hopZ5△hopH1突变体的坏死斑和细菌数量显著低于野生型，而互补菌株可恢复致病力，表明HopH1和HopZ5是Psa在感病寄主中发挥完全毒力所必需的。令人意外的是，在抗病品种'白果'上，双突变体引起更严重的坏死症状，细菌数量显著高于野生型，且互补后恢复至野生型水平，提示HopZ5可能被'白果'中未知的R蛋白识别。https://www.graphpad.com/);each treatment contained three replications,and 15 discs,collected from 4 healthy plants of each cultivar,were used for each replication. three leaf discs were randomly selected from each treatment for symptom record and bacterial growth test. Abbreviations: ns,not significant;,significant at P<0.05;*,significant at P<0.01'>HopH1 interacts directly with ZAR1 homologs of kiwifruit通过荧光素酶互补实验证实HopH1与猕猴桃ZAR1同源蛋白(AcZLP1和AeZLP1)直接互作。系统发育分析显示'白果'和'红阳'分别含有5个和6个ZAR1同源基因，其中AeZLP1和AcZLP1与拟南芥ZAR1同源性最高(约49%)，提示HopH1可能通过调控HopZ5活性或形成复合体被未知R蛋白识别。本研究成功建立了CRISPR/FnCas12a系统在Psa中的高效基因组编辑平台，相比传统SacB技术将突变体构建时间缩短近半。该系统的独特优势在于可实现双向删除(86-972bp)且无需供体DNA模板，通过引入外源NHEJ修复蛋白显著提升编辑效率。研究发现hopH1和hopZ5在感病寄主中发挥毒力因子功能，而在抗病寄主中可能被特异性识别，这一矛盾现象揭示了效应蛋白在病原体-寄主协同进化中的复杂角色。该研究不仅为植物病原体功能基因组学研究提供了强大工具，更重要的是揭示了Psa3特有效应蛋白在寄主特异性中的关键作用。双突变体在抗病品种上表现出的增强致病力，为理解"防卫基因对"互作提供了新视角，对猕猴桃抗病育种具有重要指导意义。未来研究可进一步解析HopH1与ZLP1互作的分子机制，以及探索效应蛋白识别特异性背后的进化驱动因素。
https://www.graphpad.com/);each treatment contained three replications,and 15 discs,collected from 4 healthy plants of each cultivar,were used for each replication. three leaf discs were randomly selected from each treatment for symptom record and bacterial growth test. Abbreviations: ns,not significant;,significant at P<0.05;*,significant at P<0.01'>
