定量单分子FLIM与PIE-FRET成像技术在生物分子系统研究中的应用与标准化

《BMC Methods》：Quantitative single-molecule FLIM and PIE-FRET imaging of biomolecular systems

本研究针对传统技术难以捕捉蛋白质和核酸结构动态变化的技术瓶颈，开发了基于时间相关单光子计数(TCSPC)的FLIM/PIE-FRET联合成像方法。研究人员通过建立标准化工作流程，在商业显微镜上实现了纳米级距离的精确测量，并在DNA标准品、RNA/DNA杂交体、脂质体包裹酶和活酵母细胞等多种体系中验证了该方法的可靠性。研究证实强度与寿命分析的FRET效率结果高度一致，为在复杂生物系统中研究瞬时相互作用和构象动态提供了重要技术支撑，将推动定量单分子时间分辨荧光技术在结构生物学和细胞生物学中的广泛应用。

　　

在生命科学领域，实时观测生物大分子的结构动态变化一直是研究人员面临的重大挑战。蛋白质和核酸的构象变化往往发生在纳秒到秒级的时间尺度，而传统技术难以捕捉这些瞬时过程。荧光显微镜虽已成为生物学研究的利器，但常规方法主要依赖荧光强度这一单一参数，无法全面反映分子的动态特性。正是在这样的背景下，时间分辨荧光技术应运而生，为研究者提供了全新的观测维度。

荧光寿命成像显微镜(FLIM)和弗斯特共振能量转移(FRET)技术的结合，特别是单分子水平的应用，为研究生物分子构象变化和相互作用提供了强大工具。然而，技术在复杂生物系统中的广泛应用仍受到技术和分析挑战的限制。为了解决这一问题，Irene Silvernail等研究人员在《BMC Methods》上发表了他们的方法论研究，探索如何将FLIM与脉冲交错激发FRET(PIE-FRET)相结合，建立标准化工作流程，使这一强大技术能够更易于被科研界采用。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：时间相关单光子计数(TCSPC)系统与共聚焦显微镜的集成配置，脉冲交错激发(PIE)模式的光路设计和数据采集，基于扩散实验的FRET效率校正因子确定方法，以及表面固定和脂质体包裹的单分子样品制备技术。研究还涉及活细胞荧光寿命成像和基于荧光强度的FRET效率计算算法优化。

单分子FLIM和PIE-FRET成像的DNA基准样品研究

研究人员首先使用先前单分子FRET基准研究中建立的DNA寡核苷酸序列作为标准样品，验证他们的FLIM/PIE-FRET方法的可靠性。这些DNA标准品通过生物素-链霉亲和素连接固定在流动池表面，通过改变供体(Atto550)和受体(Atto647N)标记位置之间的距离，构建了低、中、高三种预期FRET效率的样品。

通过同时采集FLIM和PIE-FRET图像，研究人员能够直观地观察到随着供体-受体距离减小，供体信号强度逐渐减弱，荧光寿命相应缩短的趋势。对单个DNA双链体的荧光强度轨迹分析表明，基于强度的FRET效率计算与基于寿命的计算结果高度一致。特别有趣的是，研究人员发现由FRET产生的受体发射信号其荧光寿命也表现出距离依赖性，这一现象揭示了FRET过程对受体量子产率的潜在影响。

RNA/DNA杂交分子和MutL酶的FLIM/PIE-FRET研究

在方法验证的基础上，研究人员将该技术应用于更具生物学意义的系统。他们设计了一种RNA/DNA杂交底物(MFU)，用于研究SARS-CoV-2核糖核酸内切酶Nsp15的切割活性和底物动力学。该底物通过生物素-链霉亲和素连接固定在流动池表面，单个分子的观测显示了相对稳定的FRET信号，计算得到的FRET效率与理论预期相符。

为了研究蛋白质构象变化，研究人员将热栖热菌(Taq) MutL酶封装在脂质体中并固定在表面。MutL是DNA错配修复途径中的关键ATP酶，其构象变化对于理解修复机制至关重要。通过FLIM/PIE-FRET成像，研究人员成功区分了仅标记供体、仅标记受体和双标记的MutL亚群，并观察到了不同的FRET状态分布，反映了酶的不同构象状态。这种方法为长期观察单个酶分子构象动态提供了可行方案。

活酵母细胞的FLIM/PIE-FRET成像

最后，研究人员将FLIM/PIE-FRET技术应用于活酵母细胞系统，研究核糖体生物发生过程中蛋白质-蛋白质的瞬时相互作用。他们通过基因工程方法在酿酒酵母BY4741菌株中内源性标记了核糖体生物发生相关因子Nop7、Rix7、Nsa1和Rea1。

通过像素级的FRET效率计算，研究人员获得了蛋白质相互作用的空间分布图。结果显示，在表达Nop7-GFP/mCherry-Rea1的细胞中，Rea1信号主要定位于细胞核，而Rix7-GFP/Nsa1-mCher7表达细胞则显示核周区域存在显著的较高FRET群体。这些发现为了解核糖体生物发生过程中AAA-ATP酶与其相互作用因子的动态提供了直观证据。

本研究建立了一套完整的FLIM/PIE-FRET实验和数据分析流程，证实了该方法在多种生物分子系统中应用的可靠性和准确性。通过DNA基准样品的系统验证，研究人员提供了标准化的工作流程和校正方法，为其他实验室采用这一技术提供了实用指南。

该研究的创新之处在于将FLIM的定量能力与PIE-FRET的特异性相结合，实现了从体外到活细胞的多尺度研究。特别值得关注的是，研究人员展示了该方法在解决具体生物学问题中的应用潜力，包括RNA底物动力学、酶构象变化和细胞内蛋白质相互作用等。

然而，研究也指出了一些需要注意的技术挑战，如校正因子的准确确定、荧光团光物理特性的复杂性以及活细胞环境中的信号解读等。未来，随着荧光蛋白FRET标准品的开发和应用，以及数据分析方法的进一步优化，这一技术有望在结构生物学和细胞生物学研究中发挥更大作用。

总体而言，这项研究为定量单分子时间分辨荧光技术的广泛应用奠定了基础，使更多实验室能够利用商业设备开展高质量的动态结构生物学研究。通过降低技术门槛，该方法将促进对生物分子构象变化和相互作用机制的深入理解，为生命科学研究提供新的视角和工具。