靶向纳米颗粒递送芹菜素通过调控CCR5/JAK1/STAT1/MMPs通路减轻脑出血后继发性脑损伤的作用及机制研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Apigenin regulates CCR5/JAK1/STAT1/MMPs signaling to alleviate secondary brain injury after intracerebral hemorrhage and its enhanced delivery via targeted nanoparticles

本研究针对脑出血(ICH)后继发性脑损伤(SBI)缺乏有效药物治疗的临床难题，开发了RVG29和叶酸(FA)双修饰的芹菜素(API)纳米颗粒(RVG/FA-NPs@API)，通过系统研究证实其可特异性靶向炎症巨噬细胞，通过共价结合JAK1蛋白Cys1052位点抑制CCR5/JAK1/STAT1/MMPs信号通路活化，显著改善血脑屏障(BBB)完整性并减轻神经元凋亡，为ICH治疗提供了新型靶向治疗策略。

　　

脑出血(ICH)是一种致死率极高的脑血管疾病，占所有卒中类型的约15%，死亡率高达70%。在脑出血发生后，血肿的机械压迫导致原发性脑损伤，而血肿内红细胞裂解释放的血红蛋白降解产物则会触发炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、神经元凋亡和血脑屏障(BBB)破坏等继发性脑损伤(SBI)过程。尽管当前外科干预可以部分降低脑出血患者的死亡率，但持续存在的SBI显著恶化临床结局。统计数据显示，约仅20%的脑出血患者在六个月内恢复基本自理能力，给家庭和社会带来沉重负担。迄今为止，尚无药物疗法被证明能特异性靶向脑出血后的SBI，这使得开发缓解脑出血诱导SBI的新治疗剂和靶点成为紧迫的医学挑战。

芹菜素(API)是一种广泛存在于自然界中的天然黄酮类化合物，主要来源于芹菜、香菜、百里香和洋甘菊等药用植物。药理学研究表明，API具有显著的抗炎、抗氧化和抗纤维化特性。值得注意的是，研究还表明API可以通过上调脑源性神经营养因子、增强神经丝蛋白合成以及增加PSD-95和突触结合蛋白的表达来促进神经发生。此外，API在蛛网膜下腔出血模型中通过抑制TLR4介导的炎症反应被证明可以保护BBB完整性。然而，API在脑出血中的作用和潜在机制尚不清楚。

在这项发表于《Journal of Nanobiotechnology》的研究中，吴嘉伟等研究人员开发了一种负载芹菜素的PLGA纳米颗粒系统(RVG/FA-NPs@API)，该系统通过修饰血脑屏障配体RVG29和巨噬细胞靶向配体叶酸(FA)，实现了对炎症巨噬细胞的靶向递送，并系统研究了其对脑出血后SBI的治疗效果及机制。

研究人员采用网络药理学分析、分子动力学模拟、表面等离子共振(SPR)、细胞热位移分析(CETSA)等技术方法，结合小鼠脑出血模型和细胞实验，系统评估了API的作用机制和神经保护效应。研究还纳入了临床脑出血样本数据，通过生物信息学分析验证了关键信号通路的活化情况。

API改善脑出血小鼠的神经功能缺损和脑水肿

研究通过胶原酶诱导的小鼠脑出血模型评估API的治疗效果。行为学测试表明，API治疗显著改善了脑出血小鼠的神经功能缺损评分、网格行走测试、旋转棒测试和前肢放置测试表现。莫里斯水迷宫(MWM)测试显示，API治疗组小鼠在目标象限停留时间和平台穿越次数显著增加，表明其空间学习记忆能力得到改善。脑组织水含量(BWC)测量发现，API剂量依赖性地减轻了基底节和皮质区的脑水肿，Evans Blue外渗实验证实API有效保护了血脑屏障完整性。

API促进血肿吸收并抑制脑出血诱导的神经元凋亡

Western blot(WB)分析显示，API剂量依赖性地增加了Bcl-2表达，降低了Bax和cleaved caspase-9水平，表现出抗凋亡效应。MAP2免疫荧光染色表明，高剂量API治疗逆转了脑出血引起的空洞性坏死，保留了神经元纤维结构。H&E染色和尼氏染色显示，API有效加速了血肿吸收，恢复了神经元形态。TUNEL染色证实，API显著减少了血肿周围凋亡细胞数量。

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API通过抑制JAK1磷酸化作用于JAK-STAT通路

网络药理学鉴定出70个API与脑出血的重叠靶点，蛋白互作(PPI)网络分析显示MMP2、MMP9、MMP3、SRC等为核心节点。分子对接和动力学模拟表明API与JAK1具有较强的结合能力(-9.9 kcal/mol)，形成氢键与Asp1039、His885和Glu925等关键氨基酸相互作用。体内实验证实，脑出血后血肿周围组织JAK1和STAT1磷酸化水平显著升高，而API治疗剂量依赖性地降低了磷酸化水平。

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API抑制JAK-STAT介导的MMP表达保护神经元免受巨噬细胞诱导的损伤

分子对接显示API与MMP9、MMP2和MMP3的结合能分别为-8.5、-7.5和-7.9 kcal/mol，表明其可能直接与MMPs相互作用。Western blot证实API剂量依赖性地降低了脑出血后血肿周围组织MMPs的表达，同时保护了ZO-1和CLDN5等紧密连接蛋白。在RAW264.7细胞中，API显著抑制了LPS诱导的MMP9和MMP3表达，并剂量依赖性地抑制p-JAK1和p-STAT1的上调。

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脑出血后血肿周围脑组织中CCR5/JAK1/STAT1/MMP通路的激活

基因表达谱分析显示，脑出血患者血肿周围组织中CCL20和CCL4表达升高，表明单核细胞/巨噬细胞可能聚集。基因表达分析还发现CCL4、CCL5、CCR5、JAK1、STAT3和MMP3高水平表达。加权基因共表达网络分析(WGCNA)表明，MEbrown和MEyellow模块与脑出血表型强相关，富集分析显示包括Chemokine signaling和Lysosome在内的通路被激活，JAK-STAT通路下游参与。

API与JAK1共定位并紧密结合

免疫荧光和pull-down实验证实API与JAK1直接结合。DARTS和CETSA分析表明API以浓度依赖性方式增加JAK1稳定性，SPR显示其与JAK1具有强亲和力(K_d=9.956×10^-6 M)。顺序添加实验表明API与JAK1的结合是不可逆的"先入为主"方式。

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RVG/FA-NPs@API的成功构建与表征

研究成功构建了具有中枢神经系统靶向性和炎症微环境响应性的芹菜素纳米递送系统(RVG/FA-NPs@API)。X射线衍射(XRD)分析显示，NPs@API在~16.7°和22.5°处呈现无定形宽峰；FA-NPs@API在~28.5°处显示额外峰；而RVG/FA-NPs@API在~19.5°和32.1°处呈现新峰。透射电镜(TEM)成像显示纳米颗粒呈球形、均匀分散且边界清晰。动态光散射(DLS)测量显示NPs@API、FA-NPs@API和RVG/FA-NPs@API的平均尺寸分别为~170 nm、187 nm和195 nm，Zeta电位分别为-20.1 mV、-24.02 mV和-28.6 mV。

RVG/FA-NPs@API抑制巨噬细胞CCR5/JAK1/STAT1/MMPs通路并减轻巨噬细胞介导的神经毒性

在LPS刺激的RAW264.7细胞中，RVG/FA-NPs@API显著降低了CCR5 mRNA和蛋白表达，以及p-JAK1和p-STAT1水平，而不影响总JAK1或STAT3。MMP9和MMP3表达也被显著抑制，TNF-α和IL-1β显著下调。免疫荧光显示iNOS减少而Arg1增加，表明从M1向M2极化转变。在Transwell共培养模型中，与RVG/FA-NPs@API处理的巨噬细胞上清液共培养的神经元活力显著增加。

RVG/FA-NPs@API减轻继发性脑损伤

在胶原酶诱导的脑出血模型中，RVG/FA-NPs@API在所有行为学测量中均表现出进一步改善。脑组织水含量分析显示，RVG/FA-NPs@API提供了额外的脑水肿减轻效果。组织学分析显示，RVG/FA-NPs@API组血肿体积更小，组织损伤减少，神经元排列更完整。TUNEL染色表明RVG/FA-NPs@API组凋亡神经元比例最低。Western blot结果支持这些发现，显示RVG/FA-NPs@API组CCR5、p-JAK1、p-STAT1、MMP9和MMP3的减少最大，同时ZO-1和CLDN5显著上调。

本研究通过构建靶向炎症巨噬细胞的RVG/FA-NPs@API，系统验证了其对脑出血小鼠SBI的显著神经保护作用。研究发现RVG/FA-NPs@API能有效靶向脑内炎症M1型巨噬细胞，显著缓解神经功能缺损、减轻脑水肿、抑制神经元凋亡。其作用机制主要涉及下调CCR5/JAK1/STAT1信号轴，抑制MMPs表达，稳定血脑屏障，减轻炎症反应和细胞毒性。

该研究的创新性在于首次发现并描述了API通过共价结合JAK1蛋白激酶结构域中保守的半胱氨酸残基Cys1052，阻断其磷酸化，抑制下游CCR5/JAK1/STAT1/MMPs信号通路，从而产生抗炎和神经保护作用，显著减轻脑出血后的SBI。RVG/FA-NPs@API纳米递送系统具有良好的生物相容性、稳定的脑靶向能力和特异的M1巨噬细胞递送能力，为脑出血的靶向免疫调节治疗提供了新的思路和潜在治疗策略。

然而，该研究仍存在一些局限性，如主要基于小鼠脑出血模型，动物与人类在病理和药代动力学方面的差异限制了直接临床转化；仅测试了有限的剂量和治疗时间窗，最佳剂量、安全性和长期疗效尚不清楚；工作主要集中于巨噬细胞CCR5/JAK1/STAT1/MMPs信号传导，而对神经元、星形胶质细胞和内皮细胞的作用探索不足。未来的研究需要在大型动物模型和临床试验中验证疗效和安全性，利用单细胞测序和空间转录组学全面阐明芹菜素在多种细胞类型和信号通路中的作用，优化治疗策略，并将RVG/FA纳米颗粒平台扩展到递送其他药物或遗传分子，用于脑出血和更广泛的神经系统疾病。