基于全长16S rRNA基因测序与内标定量技术优化人类微生物组精准定量分析新方法

《BMC Microbiology》：Quantitative profiling of bacterial communities via full length 16S rRNA gene sequencing with internal controls: optimization and validation across diverse human microbiomes

本研究针对微生物负荷精准定量在感染诊疗中的临床需求，通过优化纳米孔全长16S rRNA基因测序技术，结合内标定量策略，系统验证了该方法在复杂人类微生物组样本中的定量性能。研究证实Emu分析流程可实现物种级分辨率，且定量准确性不受DNA投入量、PCR循环数等参数影响，为临床微生物快速鉴定与绝对定量提供了可靠技术方案。

　　

在感染性疾病诊疗与医院感染控制领域，准确评估微生物负荷犹如握住了打开精准医疗大门的钥匙。传统微生物培养方法虽能提供重要信息，却受限于培养条件苛刻、难以覆盖所有微生物的瓶颈，且需进行系列稀释增加操作复杂度。更关键的是，高通量测序技术产生的相对丰度数据属于成分数据，当比较不同环境中相似微生物的绝对丰度时，相对比例可能无法反映数量级上的真实差异，导致结论偏差。

正是在这一背景下，Ezra Valido等研究团队在《BMC Microbiology》上发表了创新性研究。他们致力于解决微生物组研究中的绝对定量难题，通过将纳米孔全长16S rRNA基因测序与内标控制策略相结合，建立了一种可靠且可扩展的微生物定量方法。这种方法不仅突破了成分数据的限制，还能在物种水平上解析复杂微生物群落，为临床环境中感染阈值判定和抗生素治疗决策提供了新思路。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先利用商业化模拟微生物群落标准品（包括ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准品和肠道微生物组标准品）进行方法优化；其次将尖峰内标（ZymoBIOMICS Spike-in Control I）整合到实验流程中实现绝对定量；通过纳米孔MinION平台进行全长16S rRNA基因（V1-V9区域）测序；采用Emu生物信息学流程进行物种级群落分析；并收集了5名健康志愿者的粪便、唾液、鼻腔和皮肤样本进行方法验证，同时与传统培养方法进行对比评估。

Emu在模拟微生物群落中解析细菌谱系的表现

研究团队首先评估了Emu分析流程在模拟群落中的分类性能。在属水平上，Emu对ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准品的解析达到Pearson r=0.94的高相关性；在种水平上，相关性仍保持在r=0.93。

值得注意的是，虽然大多数物种被准确识别，但 Pseudomonas（假单胞菌）的比例被低估（低于0.5%而非预期的4%）。在更复杂的肠道微生物组标准品测试中，属水平相关性为r=0.83，而种水平降至r=0.28，尤其对 Veillonella rogosae 和 Bifidobacterium adolescentis 等物种的识别存在困难，这反映了16S rRNA基因序列高相似性带来的分类挑战和引物设计的局限性。

初始DNA量、PCR循环数和尖峰比例对细菌定量的影响

研究人员系统评估了关键实验参数对定量准确性的影响。结果显示，25个PCR循环的Pearson r相关系数范围为0.90-0.93，而35个循环为0.87-0.88，表明较少循环数能提供更优的相关性。

不同DNA输入量（0.1ng、1.0ng和5ng）下，估计的细菌丰度均保持在预期范围内。在尖峰比例测试中，不同比例（0.01%-10%）的尖峰内标并未显著改变定量估计，但当尖峰比例过低（0.01%）时，其中一个尖峰物种未能被检测，导致该数据点缺失。这强调了保持适当尖峰比例以确保内标物种被准确测序的重要性。

不同样本类型的微生物组定量分析

为验证方法在真实场景下的适用性，研究团队将其应用于四种人体部位样本（皮肤、鼻腔、唾液和粪便）。定量结果显示，16S rRNA测序估计值与培养菌落形成单位（CFU）高度一致，Pearson r达到0.94。

各样本类型的细菌丰度估计值为：粪便10⁹-10¹⁰细胞/克，唾液10⁸-10⁹细胞/毫升，鼻腔拭子10⁶-10⁷细胞/毫升，皮肤拭子10⁵-10⁶细胞/毫升。Beta多样性分析显示不同来源样本形成明显聚类，证实方法能捕获部位特异的微生物特征。共享菌种比例分析显示，唾液样本最高（59%），其次为皮肤（29%）、鼻腔（23%）和粪便（18%）。

研究结论与讨论部分强调，全长16S rRNA基因测序结合Emu分析流程能在物种水平准确识别微生物组，而尖峰内标的引入可实现跨样本类型的细菌负荷定量，且不受DNA输入量、PCR循环数或尖峰比例影响。然而，方法在低微生物量样本（如含高宿主DNA的拭子样本）中仍面临挑战，且对高相似16S rRNA基因序列物种的区分存在局限。这些限制可通过优化纳米孔测序化学、流动槽和基序识别算法来改善。

该研究的核心意义在于建立了基于纳米孔测序的微生物绝对定量流程，为临床感染诊断提供了与传统培养方法高度一致且更全面的替代方案。通过将微生物鉴定与负荷估计相结合，该方法有望在尿路感染诊断等需要阈值判定的临床场景中发挥重要价值，推动微生物组研究从相对丰度向绝对定量迈进。