中国家鸡源鸭瘟杆菌基因组特征揭示RTX毒素系统为核心毒力因子及抗生素耐药性进化

《BMC Microbiology》：Genomic characteristics, antimicrobial resistance profiles and virulence factors of Gallibacterium anatis isolates from layer chickens in Northern China

本研究针对家禽生产中日益严重的鸭瘟杆菌(Gallibacterium anatis)感染问题，通过对中国北方蛋鸡分离的5株临床菌株及31株全球菌株进行全基因组测序和比较基因组分析，系统揭示了该病原体的基因组特征、耐药性进化规律和毒力因子分布。研究发现RTX毒素系统(gtxA/gtxB/gtxD)在97-100%菌株中高度保守，可作为通用疫苗靶点；中国分离株的聚类模式与国际种禽引进历史高度吻合，且当代菌株相比历史菌株F149表现出广泛的多药耐药性。该研究为家禽细菌病防控提供了重要分子依据，论文发表于《BMC Microbiology》(2025)。

　　

在全球家禽肉消费量过去二十年增长86%的背景下，家禽疾病已成为影响动物福利和造成重大经济损失的主要因素。其中，由常驻微生物群引起的疾病尤为棘手，败血症是家禽死亡的重要原因，而鸭瘟杆菌(Gallibacterium anatis)作为一种新发病原体，近年来被确认为败血症病例的关键病原。尽管早在1950年就被发现，但直到2003年才被正式归类为巴斯德菌科(Pasteurellaceae)中的独立属。这种细菌具有异常广泛的宿主范围，不仅存在于鸡、鸭、鹅、鸽等家禽中，还存在于各种野生鸟类中。

鸭瘟杆菌的致病机制复杂且多变，它既是健康禽类上呼吸道和下生殖道的正常微生物群组成部分，又是一种重要的机会性病原体，与腹膜炎、输卵管炎、卵巢炎、肝炎和呼吸道综合征等多种病理状况相关。更令人担忧的是，该菌会导致产蛋量下降8-10%，在实验性免疫抑制蛋鸡中死亡率高达73%，还可引起公鸡附睾炎，导致精液质量下降。近年来，抗生素治疗鸭瘟杆菌感染变得日益困难，多药耐药菌株不断出现，对氨苄青霉素、克林霉素、多西环素、青霉素、磺胺甲恶唑、四环素和泰乐菌素等多种抗生素产生耐药性。

为了解决这一迫切问题，研究人员开展了针对中国北方蛋鸡源鸭瘟杆菌分离株的基因组特征、抗菌药物耐药谱和毒力因子的系统性研究。通过对5株临床分离株进行全基因组测序，并结合31株全球菌株的比较基因组分析，揭示了该病原体的进化规律和致病机制。

本研究主要采用全基因组测序技术，结合Illumina和PacBio平台获得高质量基因组数据。通过比较基因组学分析36株菌株的系统发育关系，使用Roary进行泛基因组分析，利用ABRicate扫描毒力因子数据库(VFDB)和抗生素耐药性数据库(CARD)。通过药敏试验检测29种抗生素的敏感性，采用CRISPRone平台鉴定CRISPR-Cas系统。所有实验均设置三次生物学重复，使用SPSS和GraphPad Prism进行统计分析。

基因组特征分析

研究显示鸭瘟杆菌基因组大小在2.25-2.81 Mb之间，平均GC含量为39.8%。中国分离株与墨西哥、德国、美国菌株显示出高度的序列相似性和结构同源性，表明尽管存在地理隔离，鸭瘟杆菌种群仍保持显著的基因组稳定性。比较基因组图谱显示，抗生素耐药基因在空间分散的菌株中高度保守，表明水平基因转移促进了抗菌素耐药性的广泛传播。

系统发育构建

泛基因组分析揭示鸭瘟杆菌具有开放性泛基因组结构，核心基因组稳定在179个基因，而泛基因组持续线性扩张而不饱和。36株菌株中，核心基因(存在于>99%菌株)179个，软核心基因(95-99%)1289个，壳基因(15-95%)1321个，云基因(<15%)2307个。系统发育分析显示中国分离株分布在多个进化枝中，其聚类模式与中国种禽进口历史高度吻合：2014年前主要从美国引进种禽，相应早期分离株TS0001与美国菌株聚类；2014年后多元化引进欧洲种禽，近期分离株(2017-2023)与丹麦、德国菌株亲缘关系更近。

毒力基因分布

研究发现毒力相关基因可分为14个功能类别，其中RTX毒素系统组分保守性最高：gtxA存在于97-100%分离株中，其分泌组分(gtxB/gtxD)存在于90-95%菌株。铁获取系统(85-90%)和应激适应机制(80-85%)同样广泛存在。相比之下，菌毛基因(30-35%)、粘附/侵袭因子(25-30%)、抗吞噬基因(20-25%)、外排泵(30-35%)和群体感应系统(15-20%)分布有限。这种差异分布凸显了鸭瘟杆菌采用毒力策略的显著多样性。

耐药基因分析与药敏试验

五株中国分离株均表现出显著的多药耐药性，而历史菌株F149对大多数抗生素敏感。DFSO2菌株对29种测试抗生素中的19种产生耐药或中度耐药，其耐药基因谱包括β-内酰胺类耐药基因(bla_EC、bla_OXA)、氨基糖苷类耐药基因(aac(6')-Iy、ant(3")-Ia、aph(3')-Ia)、四环素耐药基因(tetB、tetR)和氟喹诺酮耐药基因(gyrA突变、parC、parE)。中国分离株的耐药谱与中国家禽生产中抗生素使用记录直接相关，特别是氟喹诺酮类、磺胺类和和大环内酯类的残留检测结果与观察到的耐药模式高度一致。

CRISPR-Cas系统

所有36个基因组均含有至少一种CRISPR-Cas系统，I型和III型最为普遍。14个菌株含有单一系统类型，20个菌株同时具有两种类型，菌株F-279和18102-2同时具有三种不同类型。中国分离株中，BJ1F2和YJ922仅含有I型系统，DFSO2、BJM2和BJF12同时具有I型和III型系统。II型系统仅存在于三个丹麦分离株中，而菌株1637独特地含有IV型系统。

本研究通过系统的基因组分析揭示了鸭瘟杆菌在中国家禽生产中的进化规律和致病机制。最重要的发现是RTX毒素系统在几乎所有菌株中高度保守，表明其作为核心毒力机制的重要性，为开发通用疫苗提供了有希望的靶点。同时，研究证实全球家禽贸易不仅促进了病原体的传播，还加速了耐药性的发展，中国分离株的聚类模式与种禽引进历史的吻合为此提供了有力证据。

从历史敏感菌株F149到当代广泛耐药菌株的转变，清晰展示了抗生素选择压力对细菌进化的影响。中国分离株的耐药谱与当地家禽生产中抗生素使用模式的高度一致性，强调了合理使用抗生素的重要性。此外，CRISPR-Cas系统的多样性反映了菌株对特定环境压力和历史噬菌体暴露的适应性进化。

该研究为家禽细菌病的防控提供了重要的分子基础，RTX毒素系统作为潜在疫苗靶点的发现尤为关键。然而，其复杂的免疫调节特性也带来了不同于猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素疫苗的挑战。未来的研究需要进一步探索RTX系统的免疫保护效果，并开发针对这一核心毒力因子的有效干预策略。这些发现不仅对家禽健康管理具有重要意义，也为理解细菌病原体的进化生物学提供了宝贵见解。