综述：调节性T细胞疗法治疗髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎

《Frontiers in Immunology》：Regulatory T cell therapy for myeloperoxidase-specific anti-neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis

本综述系统探讨了MPO-AAV的发病机制，重点聚焦于Treg细胞功能失调在疾病中的作用，并前瞻性地评述了基因工程Treg（包括CAR-Treg与TCR-Treg）作为一种能够特异性重建对自身抗原（MPO）耐受性的潜在新型疗法，为开发靶向性强、毒性低的新治疗方案提供了重要见解。

　　

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）是一种罕见的自身免疫性疾病，其特征是小血管炎症。该病最常见由针对中性粒细胞溶酶体中蛋白酶3（PR3）和髓过氧化物酶（MPO）的ANCA引起。最常受累的器官是呼吸道和肾脏，但其他器官也可能被累及。虽然PR3-AAV和MPO-AAV的病因相似，但它们的发病机制不同。表观遗传和遗传因素可能在疾病发展中起作用，例如携带HLA-DRB1 * 04:05等位基因的中国人群在MPO-AAV患者中更为普遍。即使有现有治疗，他们的预后通常较差，常导致终末期肾衰竭。目前AAV的治疗严重依赖糖皮质激素，长期使用具有毒性。因此，迫切需要为该病开发新的、毒性更低且靶向性强的疗法。调节性T细胞（Treg）疗法是一种新型疗法，具有特异性重建对靶自身抗原（MPO或PR3）耐受性的潜力。

分类和临床表现

根据2012年修订的Chapel Hill共识会议，AAV可分为肉芽肿性多血管炎（GPA）、显微镜下多血管炎（MPA）和嗜酸性肉芽肿性多血管炎（EGPA）。GPA表现为坏死性血管炎伴血管外肉芽肿，通常累及呼吸道和肾脏；而MPA类似GPA，但无肉芽肿形成。EGPA的特点是在嗜酸性粒细胞增多的情况下出现坏死性肉芽肿性血管炎，通常累及呼吸道并与哮喘相关。一个著名的疾病表现是在受累组织区域检测到极少或无免疫复合物沉积。这导致了少免疫性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）这一有趣的疾病表现。免疫复合物的缺失是由于死亡中性粒细胞释放的弹性蛋白酶消化了免疫球蛋白。

此外，PR3-ANCA通常与GPA相关（约85%的患者），而MPO-ANCA更常与MPA相关（约60%的患者）。ANCA的滴度与疾病严重程度无关，因为ANCA可在无症状或健康个体中发现。MPO-AAV的致病性T细胞表位已在疾病的实验模型中得到阐明。

MPO-AAV的表观遗传和遗传因素

近年来AAV的患病率从每百万人口48-184例上升至300-421例，表明患者生存率提高。研究人员已通过全基因组关联研究（GWAS）调查患者中可能存在的遗传变异和亚群，这可能是理解疾病发病机制的关键。PR3-AAV主要见于白种人，而MPA在亚洲人（如中国人和日本人）中占主导，表明不同遗传亚群的作用。研究支持该疾病与非主要组织相容性复合体（MHC）和MHC相关，尽管MPO-AAV主要与MHC II类等位基因相关。日本MPO-AAV患者倾向于DRB1 * 09:01作为风险等位基因，而中国患者常携带DQA1 * 03:02、DQB1 * 03:03和DRB1 * 04:05。特别是，携带DRB1 * 04:05的MPO-AAV患者预后最差，约50%的患者在诊断后1年内进展为终末期肾衰竭（ESRF）。

其他因素包括感染、药物和二氧化硅暴露也与疾病进展相关。携带金黄色葡萄球菌的患者更容易复发，因为金黄色葡萄球菌感染会触发PR3-AAV的疾病发作。这是因为金黄色葡萄球菌表现出与PR3_105-201互补肽的分子模拟，B细胞通过产生针对该cPR3_105–201肽的抗体作出反应。然而，产生的抗体也被发现对PR3_105-201有反应，促进了患者的自身免疫。而在MPO-AAV中，Ooi等人证明某些金黄色葡萄球菌菌株携带质粒编码的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶氨基酸序列（6PGD_391-410）可通过分子模拟触发抗MPO免疫。某些药物如抗甲状腺药丙硫氧嘧啶（PTU）常与MPO-AAV相关，尽管其确切机制未知，这进一步增加了特定人群发生AAV的风险。二氧化硅暴露的强度也影响AAV的发展，尽管其确切机制未知。

先前的研究已经确定了MPO的免疫优势区域，该区域倾向于位于MPO重链的“热点”区域。使用患者血清绘制这些免疫原性表位图，并发现T细胞和B细胞共享表位，进一步强调了热点区域的重要性，因为它们在缓解期患者中持续存在。Ooi等人在小鼠研究中使用的人源嵌合MPO免疫原性表位MPO_435–453位于热点区域内，而临床研究已确定MPO_393-402、MPO_437-446、MPO_447-461、MPO_479-488、MPO_717–726具有免疫原性。

诊断

目前，患者根据临床症状、病理学检查（尿液和血液）和组织活检进行诊断。然而，必须注意，ANCA阳性并不一定意味着患者患有AAV，也可能是其他自身免疫性疾病，如狼疮性肾炎（LN）、炎症性肠病（IBD）、溃疡性结肠炎（UC）和自身免疫性肝炎（AIH）。伯明翰血管炎活动评分（BVAS）是临床医生用来量化患者疾病活动度的成熟工具。组织活检的组织学检查仍然是诊断AAV的金标准。将其与免疫复合物小血管炎区分开来至关重要，因为这决定了患者的治疗类型和预后。

MPO-AAV的发病机制

先天免疫反应

AAV的发病机制尚未完全阐明，建议的途径基于患者和实验观察。自身抗原MPO是一种隔离抗原，存在于中性粒细胞的溶酶体中。因此，需要刺激来激活中性粒细胞，导致膜结合MPO在中性粒细胞中上调。促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）通常是疾病发作的触发因素，这常发生在感染时。感染因子的存在刺激树突状细胞释放转化生长因子β（TGFβ）和白介素6（IL-6）。B细胞产生的ANCA与活化中性粒细胞上的膜结合MPO结合。这进而触发初始T细胞分化为辅助性T细胞17（Th17）并产生IL-17。IL-17是一种有效的促炎细胞因子，刺激免疫系统，包括单核细胞和巨噬细胞释放TNFα和IL-1β，在疾病急性期进一步启动中性粒细胞。发现肾脏中性粒细胞也能够产生促炎细胞因子TNFα和IL-17，促进Th17细胞的分化。先天γδ T细胞迁移到炎症部位并产生IL-17，促进疾病发展。

研究表明，经TNF-α启动的中性粒细胞上调MPO的膜表达，允许MPO与MPO-ANCA相互作用，其中MPO-ANCA作为Fcγ受体和MPO之间的桥梁。相邻中性粒细胞的FcγR然后可以识别这些ANCA的Fc部分，导致中性粒细胞活化，从而释放活性氧（ROS）杀死“受害”中性粒细胞。这导致中性粒细胞经历呼吸爆发、脱颗粒、释放中性粒细胞胞外陷阱（NETosis）、凋亡和坏死。

此外，FcγR成为补体的靶点，激活经典和替代补体途径，促进中性粒细胞的破坏。特别是，C5a是两种途径中的核心补体，研究显示患者循环中C5a水平升高。中性粒细胞上C5a受体的消融也能减轻疾病表型，表明其可能是一个治疗靶点。尽管FcγR的重要性已被阐述，但FcγRIIB作为唯一的抑制性Fc受体，调节和维持外周耐受。体内小鼠模型显示，FcγRIIB缺陷小鼠出现更严重的肾小球损伤。整个过程释放促炎细胞因子，通过粘附到血管壁并经历血细胞渗出，吸引更多中性粒细胞到该部位。随后发生血浆渗出，凝血因子的存在促进纤维蛋白样坏死的形成，最终破坏脆弱的内皮单层。

适应性免疫反应的参与

B细胞

B细胞负责产生自身抗体，一些研究表明这源于调节性T细胞（Treg）的缺陷或功能障碍，导致免疫耐受丧失。中性粒细胞也通过释放B细胞活化因子（BAFF）/B淋巴细胞刺激因子（BLyS）来发挥作用，后者刺激B细胞分化、增殖和免疫球蛋白（Ig）产生。表达CD5且对IL-10产生重要的调节性B细胞（Breg）在疾病中下调。这些Breg在抑制活化T细胞和支持Treg分化方面起关键作用。研究表明，CD5⁺CD24^hiCD38⁺ B细胞在疾病活动期减少，但在缓解期恢复到与健康对照（HC）相当的水平。此外，CD4⁺ T细胞通过产生IL-21促进B细胞刺激。

T细胞

T细胞在疾病发病机制中起着关键的、非冗余的作用。它们介导迟发型超敏反应（DTH），使炎症持续存在，最终导致组织破坏。

CD4⁺辅助性T（Th）细胞是适应性免疫的核心，激活B细胞、招募巨噬细胞并促进细胞毒性T细胞反应，所有这些都驱动自身免疫反应。Gan等人证明，消耗MPO特异性CD4⁺ T细胞可改善GN，突出了它们在疾病活动中的重要性。具体而言，Th1细胞参与致肾炎免疫反应，其中IL-12p40指导Th1细胞诱导新月体GN。Th1和Th2细胞之间的平衡对于维持自身免疫耐受至关重要。Th1细胞通过产生IFNγ驱动自身免疫疾病的严重程度和进展，而Th2细胞则起相反作用。Th17细胞是另一个与自身免疫相关的亚群，因其促炎性质。视黄酸相关孤儿核受体γt（RORγt）是Th17细胞分化的重要转录因子，其缺失可减轻GN。TGFβ和IL-6共同促进Th17谱系分化，但单独TGFβ支持Treg分化。Th17细胞产生IL-17，显著促进疾病表现，IL-17水平升高加剧新月体GN的形成。IL-17A不仅激活Th17细胞，还增强中性粒细胞和巨噬细胞的招募。

在实验性抗MPO GN小鼠模型中，消耗MPO特异性CD8⁺ T细胞可改善肾损伤，表现为蛋白尿、血尿素氮（BUN）和蛋白尿减少。值得注意的是，即使在缺乏CD4⁺ T细胞的情况下，CD8⁺ T细胞也能在MPO⁺环境中介导肾小球损伤，突出了它们独立的致病潜力。这些CD8⁺ T细胞是促炎细胞因子如干扰素γ（IFNγ）和TNF的主要来源。此外，IL7R（CD127）信号传导对效应T细胞（Teff）功能至关重要，转录组分析显示其表达增加。

此外，负责识别病原体相关分子模式的Toll样受体（TLR）被发现参与疾病发病机制。TLR2的激活刺激IL-17A产生，促进Th17细胞活性，而TLR9通过Th1定向谱系途径增强抗MPO驱动的自身免疫。另外，TLR4在肾小球中组成型表达，并且在GN期间其表达上调，驱动趋化因子CXCL1和CXCL2的产生，它们是中性粒细胞的主要趋化因子。实验性小鼠抗MPO模型进一步显示，脂多糖（LPS）可与抗MPO自身免疫协同作用，加剧NCGN疾病表型。总的来说，这些发现表明感染和先天免疫激活可以放大抗MPO驱动的自身免疫。

调节性T细胞

T细胞的一个亚群，即调节性T细胞（Treg），是自身耐受和免疫稳态的关键介质。Treg的关键作用最早由Sakaguchi等人在1990年代阐明，他们发现将CD4⁺CD25⁺ T细胞过继转移给无胸腺小鼠可以预防自身免疫疾病，而CD4⁺CD25^- T细胞则不能。在小鼠中观察到的scurfy表型与Forkhead盒蛋白p3（Foxp3）基因的突变有关，该基因也与人类的免疫失调、多内分泌病、肠病、X连锁（IPEX）综合征有关。该综合征由Foxp3的隐性突变引起，导致严重的自身免疫表现，强调了Foxp3在Treg功能中的重要作用。

Foxp3是Treg中独特表达的转录因子，但其精确的调控机制仍未完全了解。在基因组水平上，Foxp3控制着对T细胞功能至关重要的基因表达，包括活化T细胞核因子（NFAT）和AML1/RunX1，这些是效应T细胞（Teff）分化所必需的。Foxp3还与RORγt相互作用，抑制初始T细胞分化为Th17，进一步阐明了其在MPO-AAV疾病机制中的作用。值得注意的是，只有全长Foxp3亚型（Foxp3fl）能与RORγt相互作用，而外显子2剪接变体（Foxp3Δ2）则不能。

鉴于其强大的免疫抑制能力，Treg是治疗自身免疫疾病的绝佳治疗工具。在MPO-AAV患者中，Treg数量常常升高，但其抑制功能常常受损，这可能归因于活化的Treg（aTreg，特征为CD45RA^-Foxp3^high）的减少。这种损伤也可能与Foxp3Δ2亚型表达增加有关，该亚型与抑制功能降低和患者群体内耐药CD4⁺ Teff细胞比例较高相关。最近的一项发现表明，Foxp3fl和Foxp3Δ2的共表达对于Treg的最佳抑制能力至关重要。

自身免疫调节因子（Aire）是一种在淋巴器官中发现的转录因子，特别是在胸腺的髓质上皮细胞（mTEC）中，它在免疫调节和中枢耐受的建立中起着不可或缺的作用。Aire使mTEC能够表达广泛的组织特异性抗原，促进自身肽在主要组织相容性复合体（pMHC）分子上呈递给发育中的T细胞。这一过程确保了对自身抗原具有高亲和力T细胞受体（TCR）的T细胞被删除或转向分化为Treg，从而产生具有多样化和高亲和力TCR库的Treg群体。Aire的重要性在实验性抗MPO小鼠模型中得到进一步强调，其中Aire缺陷小鼠由于自身反应性抗MPO T细胞的逃逸而表现出更严重的疾病表型。

Treg自然地在胸腺中发育（nTreg），但它们也可以在外周由初始T细胞诱导产生（pTreg）。虽然pTreg可以在抗炎细胞因子如TGFβ和IL-10存在下被短暂诱导，但在促炎条件下它们可能恢复为Teff细胞。TGFβ对于pTreg的诱导至关重要，因为它磷酸化Smad转录因子Smad2和Smad3，这些因子与Foxp3基因位点的保守非编码序列（CNS）1区相互作用，驱动Foxp3表达，从而促进Treg分化。稳定的Treg身份通过表观遗传机制维持。在nTreg中，Foxp3基因的CNS2区域（称为Treg特异性去甲基化区域（TSDR））的CpG岛保持低甲基化状态，支持持续的Foxp3表达和Treg谱系稳定性，即使在炎症环境中也是如此。TSDR的甲基化状态区分nTreg和pTreg，并且对长期抑制功能至关重要，因为TSDR去甲基化能够使关键转录因子结合并保留细胞记忆。TSDR包含几个对Treg分化和功能至关重要的基因，包括Foxp3、Ctla4、Il2ra、Ikzf4和Tnfrs18。除了建议的表型外，发现CD127与Foxp3⁺细胞呈负相关，如果包含此标记物，分离的Treg群体纯度更高。因此，目前Treg的最佳表型是CD4⁺CD25^highCD127^lowFoxp3⁺。

先前的前沿工作揭示了Treg如何发挥作用，尽管其确切的工作机制仍未知。一种主要的抑制模式是分泌抑制性细胞因子IL-10、IL-35和TGFβ，它们共同作用以抑制效应免疫细胞的活性。IL-35是由Epstein-Barr病毒诱导基因3（Ebi3）和白介素12α（Il12a）配对形成的异源二聚体，能够有效抑制T细胞增殖。Treg还通过产生颗粒酶A和B介导细胞毒性，这些酶参与直接杀伤靶细胞。Treg上CD25的高表达使它们能够清除IL-2（一种对T细胞存活至关重要的细胞因子），从而剥夺Teff的这种生长因子，尽管仅IL-2耗竭并不能完全解释Treg介导的抑制。另一个关键机制涉及通过Treg上的CD73/CD39外切核苷酸酶途径产生胞周腺苷。这种腺苷作用于活化T细胞上的腺苷2A（A2A）受体，有效抑制它们的活性。A2A受体的激活也抑制Teff产生IL-6，同时促进TGFβ生成，进一步将免疫反应转向调节而非炎症。此外，Treg通过淋巴细胞活化基因（LAG）3和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA）-4与树突状细胞（DC）相互作用。这些相互作用促进耐受性DC的发育，后者可以产生免疫调节酶，如吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO），从而抑制T细胞反应。Odobasic等人已经在实验性小鼠抗MPO GN模型中证明了这些耐受性DC的重要性。

当前动物模型

动物模型对于研究像MPO-AAV这样的疾病至关重要，因为它们使研究人员能够识别治疗靶点并在体内评估潜在治疗方法。然而，大多数当前的MPO-AAV模型主要复制疾病的急性期而非完全缓解期，这突出表明需要改进的模型以更好地捕捉人类疾病的复杂性。总结来说，目前有4种方法在小鼠中诱导MPO-AAV。

将IgG、脾细胞、MPO特异性T细胞被动转移至小鼠

基础的抗MPO GN小鼠模型由Xiao等人开发，并在理解MPO-AAV发病机制方面发挥了重要作用。在该模型中，首先用MPO免疫MPO敲除（MPO^-/-）和重组激活基因2缺陷（Rag2^-/-）小鼠（Rag2^-/-小鼠缺乏T细胞和B细胞）以诱导抗MPO免疫反应。然后从这些免疫小鼠中分离IgG并注射到野生型（WT）或Rag2^-/-小鼠中。这种转移可靠地诱导局灶性坏死性GN，直接证明抗MPO IgG alone可引起肾损伤。当将MPO免疫的MPO^-/-小鼠的脾细胞转移到WT和Rag2^-/-小鼠时，疾病严重程度增加。这些受体小鼠出现严重的NCGN，BUN和血清肌酐显著升高，表明肾功能严重障碍。通过引入促炎刺激如LPS，可以进一步加剧疾病，导致更严重的病理。尽管该模型在确定抗MPO抗体和免疫细胞的致病性方面很有用，但它们有局限性。值得注意的是，常观察到肾小球免疫复合物沉积，这与人类MPO-AAV病例中的少免疫模式不同。因此，虽然这些模型对于剖析疾病机制和测试疗法非常宝贵，但需要进一步改进以更准确地反映人类疾病。

转移MPO完整的骨髓

另一种策略是先免疫MPO^-/-和WT小鼠MPO，然后进行照射。随后将来自初始WT或MPO^-/-小鼠的骨髓移植到这些免疫受体中，以重新填充它们的免疫细胞。只有接受WT骨髓的小鼠在移植后出现NCGN，而接受MPO^-/-骨髓的小鼠则不出现。这一发现强调了受体小鼠外周血中MPO阳性中性粒细胞对于移植后疾病发展的必要性。这些结果表明，免疫细胞，特别是中性粒细胞，是抗MPO IgG的致病靶点。

主动免疫MPO诱导实验性GN

实验性抗MPO GN小鼠模型特别有价值，因为它能够研究耐受丧失和活动性自身免疫的发展。该模型还通过允许重新建立免疫耐受来促进潜在治疗靶点的识别，这在被动转移模型中是不可能的。在这种方法中，用人类MPO致敏WT和MPO^-/-小鼠以诱导抗MPO抗体。十天后，给这些小鼠注射绵羊抗小鼠肾小球基底膜（GBM）以激活中性粒细胞并将MPO沉积在肾小球中，从而诱导实验性MPO-ANCA。使用最小剂量的绵羊抗小鼠GBM很重要，因为它触发中性粒细胞流入肾小球而不引起显著的抗GBM疾病，后者会混淆结果。重要的是，只有MPO致敏的小鼠出现疾病，证实了抗MPO免疫和MPO沉积在疾病发病机制中的必要性。还包括卵清蛋白（OVA）作为无关抗原对照以确认模型的特异性。该模型增进了我们对CD4⁺和CD8⁺ T细胞以及B细胞在疾病发病机制中作用的认识。

尽管上述动物模型对于MPO-AAV的研究已经成熟，但探索它们之外的选项对于促进对疾病后期阶段的理解是必要的。人源化小鼠模型和类器官是临床前模型发展的有希望的下一步。利用免疫缺陷小鼠允许人细胞移植，为研究细胞和组织相互作用创建3D环境，然而，这通常昂贵且面临跨物种差异的共同限制。另一方面，具有成本效益的基于类器官的方法很有吸引力，因为它符合减少动物使用的同时保留跨物种翻译能力。肾脏是一个复杂的器官，3D类器官的开发仍在进行中，努力以可重复的条件模拟肾脏环境。尽管如此，仍需要更多的研究来开发合适的临床前模型，以协助研究慢性疾病发病机制和治疗靶点。

治疗

当前疗法

AAV的治疗分为两个阶段：诱导缓解和维持治疗。目前严重AAV的标准治疗是糖皮质激素（通常是泼尼松）联合环磷酰胺（CYC）或利妥昔单抗（RTX）。口服CYC由于药物暴露时间较长而具有更大的毒性，因此首选脉冲静脉注射（i.v.）CYC，尽管复发风险较高。这一偏好得到证据支持，显示接受静脉CYC的患者肾功能损害更少，白细胞减少症病例也更少。CYC的毒性源于其广泛的免疫抑制作用，常导致机会性感染，如耶氏肺孢子菌肺炎、出血性膀胱炎、恶性肿瘤和性腺衰竭导致不孕。同时，RTX是一种抗CD20单克隆抗体药物，通过消耗B细胞来阻止ANCA产生。如果担心CYC过量或患者易复发，则优选RTX。此外，RTX已被证明通过诱导B细胞凋亡来增强Treg的免疫调节能力，尽管B细胞耗竭可能导致低丙种球蛋白血症，进而引起免疫抑制。

为了最小化累积CYC暴露，在疾病早期考虑替代疗法，如甲氨蝶呤（MTX），尽管需要更长的治疗时间且复发率高于CYC。维持治疗可能涉及MTX或硫唑嘌呤（AZA），两者都不劣于CYC且不良事件较少。来氟米特和霉酚酸酯（MMF）较少使用，因为来氟米特与较高频率的不良事件相关，而MMF在MPO-AAV患者中显示疗效低于AZA，除非肾病患者病情较轻。

鉴于长期免疫抑制治疗的毒性，正在探索生物制剂。TNFα阻滞剂如依那西普已在GPA患者中进行测试，但未证明对MPO-AAV患者有效。相反，对于有肺和肾受累的严重病例，考虑将血浆置换作为辅助治疗，尽管最近的研究显示其并不优于标准治疗。然而，这些患者的长期结果显示出有希望的结果，因为他们需要更低剂量的类固醇进行维持治疗，从而降低了毒性。阿伐可泮（CCX168），一种C5a抑制剂，在替代糖皮质激素进行维持治疗方面显示出前景，可能降低AAV患者的发病率和死亡率。患者可以免于高剂量类固醇，对肾功能恢复更安全。低剂量IL-2是另一个新兴选项，选择性刺激Treg细胞以调节免疫反应。最近一项利用空间转录组学和数字药理学的研究发现，乌司奴单抗（一种靶向IL-12和IL-23的人源单克隆抗体）对疾病缓解有效。它有效抑制患者发炎肾脏中占主导地位的Th1/Tc1和Th17/Tc17细胞，表明通过结合现有药物和快速免疫分析进行个性化治疗的使用。

未来疗法

虽然当前标准治疗有成熟的临床试验结果支持，但保留肾功能是首要任务，并且经过几次复发事件后，患者最终会发展为终末期肾衰竭。因此，探索替代治疗选项很重要，最近新兴的基于细胞的疗法取得了成功，它通过直接靶向疾病机制提供个性化治疗且副作用更少。

过继性细胞转移

先前利用Treg强大免疫抑制能力的尝试已导致多项研究评估其在治疗自身免疫疾病和预防移植物排斥方面的功效。体外扩增的多克隆Treg已在多种临床环境中进行测试，并在诱导免疫耐受方面显示出前景。该过程涉及从患者外周血单核细胞（PBMC）中分离Treg，在体外扩增，然后回输给患者。

多项研究表明，过继转移Treg可减轻免疫介导疾病的症状，如哮喘、移植物抗宿主病（GvHD）以及几种自身