栽培参数的变化会影响HepaRG细胞中细胞色素P450基因的转录：这对体外毒理学评估具有意义

《Frontiers in Pharmacology》：Changes in cultivation parameters impact cytochrome P450 gene transcription in HepaRG cells: implications for in vitro toxicological assessments

HepaRG细胞系作为肝毒性测试模型，其CYP酶表达受细胞密度、培养方法、单层损伤和时间点影响。研究通过RT-qPCR发现，推荐细胞密度和时间点（2周后）对CYP转录影响最大，非常低或非常高密度导致转录显著降低，且与时间点呈交互效应。单层损伤对转录影响微弱，不同培养方法无显著差异。摘要结束。

　　在当前的研究中，HepaRG细胞系因其在肝毒性评估中的广泛应用而受到关注。这种来源于肝癌细胞的细胞系能够分化为两种不同的细胞类型，即胆管样细胞和肝细胞样细胞，从而在一定程度上模拟成熟的人类肝细胞的功能。HepaRG细胞在药理学和毒理学研究中具有重要价值，尤其在评估外源性化合物与细胞内代谢反应的相互作用方面。由于CYP酶（细胞色素P450酶）在第一阶段代谢中起着关键作用，它们的表达水平对评估物质的潜在毒性至关重要。然而，CYP酶的表达水平可能受到多种因素的影响，如细胞接种密度、细胞单层损伤以及mRNA提取的时间点。因此，为了确保实验结果的可靠性和一致性，研究者需要系统地探讨这些因素对CYP基因转录水平的影响。

本研究通过分析两种不同的培养方法，对12种主要的CYP基因（如CYP1A1、1A2、27A1、2B6、2C19、2C8、2C9、2D6、2E1、3A4、3A5、8B1）的转录水平进行评估。研究者采用RT-qPCR技术，以不同细胞密度接种细胞，并在分化完成后两个不同的时间点提取mRNA，同时比较了受损和未受损细胞单层的情况。研究结果显示，时间点和细胞接种密度是影响CYP基因转录水平的两个最关键因素，而培养方法和细胞单层损伤的影响相对较小。具体而言，CYP基因的转录水平在极端细胞密度下显著下降，但在分化完成后额外培养两周后，这种影响有所缓解，甚至出现转录水平的上升趋势。此外，时间点的差异也对部分基因的转录水平产生明显影响，尤其是在推荐细胞密度下的情况下，某些基因如CYP2E1和CYP8B1在分化后两周的转录水平明显高于分化后的时间点。

研究进一步揭示了不同CYP基因对培养条件的响应存在差异。例如，对于CYP1A1和CYP1A2，低细胞密度反而促进了其转录水平的提升，而高细胞密度则导致转录水平的下降。这种现象可能与细胞间相互作用、空间限制或细胞压力有关。此外，对于CYP27A1，研究并未观察到明显的转录水平变化趋势，这可能与其独特的调控机制有关。因此，研究者认为，CYP基因的表达模式在很大程度上取决于其自身的调控机制，以及所处的细胞微环境。

关于细胞单层的损伤，研究发现其对CYP基因转录的影响较小。尽管有研究表明细胞单层的损伤可能会引起基因表达的变化，但在本研究中，这种影响的幅度有限，且在不同时间点的差异并不显著。这可能是因为HepaRG细胞具有一定的自我修复能力，或者损伤对细胞整体代谢功能的影响较为微弱。然而，尽管影响较小，研究者仍建议在实验过程中注意细胞单层的完整性，以确保实验结果的准确性。

在讨论部分，研究者指出，尽管HepaRG细胞在培养过程中表现出一定的稳定性，但不同培养参数的组合仍可能对基因表达产生显著影响。例如，某些基因在分化后两周的转录水平显著高于分化后的时间点，这可能意味着在评估物质的肝毒性时，需要考虑细胞培养的时间因素。此外，研究还提到，尽管培养方法对CYP基因的表达没有显著影响，但不同方法可能导致细胞在分化后的功能表现存在差异。因此，实验设计时应尽量采用标准化的培养流程，以减少因方法不同而引入的变异性。

研究还强调了细胞接种密度的重要性。虽然推荐的细胞密度能够维持相对稳定的CYP基因表达，但极端密度下的细胞可能会因空间限制或细胞间相互作用的缺乏而导致转录水平的下降。因此，研究者建议在实验过程中通过显微镜观察细胞的生长状态，以确保接种密度处于适宜范围内。此外，显微镜图像显示，低密度接种的细胞形成较少的肝细胞样簇，而高密度接种的细胞则可能因过度拥挤而表现出不同的形态特征。

在实际应用中，HepaRG细胞作为肝毒性研究的模型，其培养条件的优化对于提高实验结果的可重复性和可靠性至关重要。研究结果表明，提取时间点和接种密度是影响CYP基因表达的两个主要因素，而培养方法和细胞单层损伤的影响则相对较小。因此，在设计实验时，研究者应优先考虑这两个参数，并通过显微镜观察和定期监测来确保细胞状态的稳定性。此外，研究还指出，虽然细胞单层损伤对基因表达的影响有限，但实验过程中仍需尽量避免此类损伤，以减少潜在的干扰因素。

研究的结论强调了在使用HepaRG细胞进行肝毒性实验前，必须充分考虑培养条件对CYP基因表达的影响。时间点和接种密度的合理选择对于确保实验结果的准确性具有重要意义。例如，某些CYP基因在分化后早期阶段表现出较高的转录水平，而在分化后较晚阶段则可能有所下降。因此，研究者建议在实验设计中根据目标基因的特性选择合适的提取时间点。此外，研究还提到，尽管培养方法对基因表达没有显著影响，但不同方法可能导致细胞在分化后的功能表现存在差异，因此在实际应用中应尽量采用标准化的培养流程，以减少实验结果的变异性。

总体而言，本研究为优化HepaRG细胞的培养条件提供了重要的参考依据。通过系统分析不同参数对CYP基因表达的影响，研究者揭示了在实验设计中需要关注的关键因素。这些发现不仅有助于提高实验的可重复性和可靠性，也为未来的研究提供了方向，即在不同培养条件下评估CYP基因对已知诱导剂的响应。此外，研究还强调了在实验过程中进行定期监测和质量控制的重要性，以确保细胞状态的稳定性和实验结果的准确性。这些结论对于推动HepaRG细胞在肝毒性研究中的应用具有重要意义，同时也为相关领域的研究者提供了实用的指导建议。