基于机器学习的房颤治疗靶点探索：单细胞与批量转录组数据的联合分析及实验验证

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Machine learning-driven exploration of therapeutic targets for atrial fibrillation-joint analysis of single-cell and bulk transcriptomes and experimental validation

为了探索心房颤动（AF）的新型治疗靶点和策略，本研究整合了GEO数据库中的转录组数据，通过机器学习算法筛选出C1orf105、DHRS9、CHGB、PDE8B、CSRP3和FCER1G六个关键基因，并构建了AUC为0.97的nomogram模型。单细胞转录组分析揭示了这些基因在心肌细胞、巨噬细胞等不同细胞类型中的特异性表达模式，而RT-qPCR和Western blot实验验证了其蛋白与mRNA表达水平的差异。研究还发现AF患者免疫微环境异常，涉及炎症细胞浸润和代谢重编程。这些发现为AF的非侵入性诊断和靶向治疗提供了新思路。

　　近年来，随着分子生物学和计算技术的迅速发展，研究者们正越来越多地采用多组学数据结合机器学习方法，以探索复杂疾病的发生机制和潜在治疗靶点。其中，心房颤动（Atrial Fibrillation，AF）作为一种常见的心律失常，其病理机制涉及多个层面的细胞和分子改变，包括心肌电生理重塑、结构重塑、异常神经调控以及炎症反应等。为了更深入地理解AF的发病机制并寻找有效的诊断和治疗手段，本研究整合了单细胞和整体转录组数据，结合三种机器学习算法，识别出与AF密切相关的关键基因，并构建了一个具有高度诊断价值的模型。研究结果不仅揭示了AF的潜在分子机制，还为非侵入性诊断和靶向治疗提供了新的方向。

AF是一种以心房电活动紊乱为特征的疾病，其发病率在全球范围内持续上升，对患者的健康、生活质量以及社会医疗负担造成了严重影响。尽管目前已有多种治疗手段，如药物治疗、导管消融术和外科手术，但这些方法仍存在一定的局限性，例如药物治疗可能伴随不良反应，导管消融术可能复发，而外科手术则因侵入性较强仅适用于特定患者群体。因此，寻找更精准、安全的诊断和治疗策略成为研究的热点。本研究采用机器学习技术，结合转录组数据，旨在识别出与AF相关的生物标志物，并通过多维度的分析方法揭示其潜在的分子机制。

在数据获取阶段，研究者从GEO数据库中筛选出多个与AF相关的转录组数据集，其中包括GSE41177、GSE115574和GSE79768。这些数据集均来源于人类心房组织，并且样本数量充足，以确保分析结果的可靠性。此外，为了验证机器学习算法筛选出的关键基因，研究者还使用了独立的数据集GSE2240进行外部验证。同时，研究还采用了GSE255612数据集，该数据集包含18例AF患者和16例非AF患者的右心耳组织样本，用于单细胞转录组分析，以揭示这些关键基因在不同细胞类型中的表达特征。

在数据预处理过程中，研究首先对三个数据集进行了批次效应的去除，以确保不同来源数据的一致性。随后，使用R语言中的“sva”包进行批次效应校正，并通过主成分分析（PCA）评估数据质量。这一过程有效减少了数据间的差异性，提高了后续分析的准确性。在差异表达分析阶段，研究采用“limmaa”包对整合后的数据进行分析，筛选出64个差异表达基因（DEGs），其中包括27个上调基因和37个下调基因。这些基因的表达变化可能反映了AF发生过程中细胞和分子层面的重要改变。

为了进一步理解这些差异表达基因的功能和作用机制，研究进行了基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）以及疾病本体（DO）的富集分析。结果显示，这些基因主要富集在与肌肉系统正调控、免疫反应和钙信号通路相关的生物学过程中。此外，KEGG分析还揭示了与心脏收缩、胰腺分泌、唾液分泌以及感染相关通路的显著富集，这提示AF可能与免疫系统异常、代谢紊乱以及心脏结构改变密切相关。DO分析进一步支持了这一结论，显示这些基因与多种疾病过程，如哮喘、结核病、自身免疫性疾病等存在显著关联。

在关键基因的筛选方面，研究采用了三种机器学习算法：LASSO回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（Random Forest, RF）。LASSO算法筛选出24个潜在的生物标志物，RF算法则根据基因重要性评分，选择了前30个基因作为候选。SVM-RFE算法通过交叉验证确定了最优的特征数量，并筛选出前30个基因作为潜在的生物标志物。最终，通过这三个算法的交集，研究确定了六个关键基因：C1orf105、DHRS9、CHGB、PDE8B、CSRP3和FCER1G。这些基因的筛选过程不仅考虑了其在转录组数据中的表达变化，还通过单细胞转录组分析，进一步揭示了其在不同细胞类型中的表达模式。

为了进一步验证这些关键基因的表达情况，研究还进行了定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western Blot, WB）实验。结果显示，DHRS9、CHGB、PDE8B、CSRP3和FCER1G的mRNA水平在AF患者的右心耳组织中显著下调，而C1orf105的表达则显著上调。这些结果与转录组分析一致，表明这些基因在AF患者中的表达变化具有一定的特异性。同时，WB实验也显示，DHRS9、CHGB、PDE8B、CSRP3和FCER1G的蛋白表达水平在AF组织中显著降低，而C1orf105则显著升高。这些实验结果不仅支持了关键基因的表达模式，还进一步验证了其在AF中的潜在作用。

为了构建一个具有诊断价值的模型，研究基于六个关键基因构建了Nomogram模型。该模型在训练集中的表现非常优异，AUC值达到了0.97，表明其在AF诊断中具有很高的准确性。为了评估模型的临床适用性，研究还进行了校准曲线分析和决策曲线分析（DCA），以验证其预测能力。此外，模型在独立的外部验证集GSE2240中的表现同样良好，进一步证明了其稳定性。这表明，Nomogram模型不仅具有较高的诊断准确性，还可能成为一种非侵入性的生物标志物检测工具，为AF的早期诊断和风险评估提供新的方法。

单细胞转录组分析则揭示了这些关键基因在不同细胞类型中的表达特征。研究发现，DHRS9和CSRP3主要在心肌细胞中高表达，而PDE8B则在脂肪细胞和心肌细胞中表达，FCER1G则主要在巨噬细胞中表达。这些细胞类型之间的表达差异可能反映了AF在不同组织中的复杂病理变化。例如，心肌细胞中的DHRS9和CSRP3可能与心肌细胞的结构重塑和代谢调控有关，而巨噬细胞中的FCER1G则可能与免疫炎症反应相关。这种细胞特异性表达模式为理解AF的发病机制提供了新的视角，并有助于识别潜在的治疗靶点。

此外，研究还对AF患者的免疫细胞浸润情况进行了分析。结果显示，AF患者的巨噬细胞和激活的树突状细胞比例显著增加，而效应记忆CD8+ T细胞的比例则显著降低。这一发现与AF患者慢性炎症状态的特征相符，表明免疫系统的异常可能在AF的发病过程中起着重要作用。这些免疫细胞的改变可能影响心房的电生理特性，从而导致AF的发生和发展。进一步的分析表明，FCER1G可能通过激活NF-κB通路促进促炎因子的释放，从而加剧心房纤维化和电生理重塑。因此，针对免疫细胞相关基因的干预可能成为一种新的治疗策略。

从功能富集的角度来看，钙信号通路、免疫微环境失衡以及心肌结构重塑被认为是AF的关键分子机制。钙信号通路在心肌细胞的电生理活动和收缩功能中起着核心作用，其异常可能直接导致心律失常的发生。而免疫微环境的改变，特别是巨噬细胞的增加和T细胞的减少，可能与AF的慢性炎症状态相关。心肌结构重塑则可能通过改变心肌细胞的排列和功能，导致心房电活动紊乱。这些发现不仅为AF的机制研究提供了新的线索，还为未来的治疗策略提供了理论依据。

值得注意的是，研究中发现的某些基因，如C1orf105和CHGB，其具体功能尚不明确，但它们与“神经内分泌调控”和“细胞增殖”等通路的关联提示了其在AF中的潜在作用。C1orf105可能通过调控细胞增殖或凋亡，参与心房结构的重塑过程，而CHGB的上调可能反映了AF患者自主神经系统失衡的特征。这些基因的功能仍有待进一步的实验验证，但它们的表达变化可能为AF的机制研究提供新的方向。

本研究还强调了整合多组学数据和先进分析技术的重要性。通过结合转录组数据和机器学习方法，研究不仅识别出关键基因，还揭示了其在不同细胞类型中的表达模式和潜在的调控网络。这种整合方法有助于从全局视角理解AF的复杂性，并为精准医学提供新的思路。例如，某些基因在心肌细胞中的表达变化可能直接反映心房电生理和结构重塑的特征，而另一些基因在血液中的表达可能为非侵入性诊断提供可能。

然而，尽管本研究取得了重要进展，仍存在一些局限性。例如，研究数据主要来源于回顾性分析，缺乏前瞻性验证；部分关键基因的具体功能仍需进一步实验验证。因此，未来的研究应关注这些基因在更广泛人群中的表达情况，并通过功能实验进一步阐明其在AF中的具体作用机制。此外，研究还建议将组织特异性机制与血液中的非侵入性检测方法相结合，以开发更全面的AF管理策略。

总的来说，本研究通过多组学数据整合和机器学习技术，揭示了AF的潜在分子机制，并筛选出六个关键基因，构建了一个具有高度诊断价值的模型。这些发现不仅有助于加深对AF的理解，还为开发新的诊断工具和治疗策略提供了理论基础。未来的研究需要进一步验证这些结果，并探索其在临床中的应用潜力，以期实现对AF的精准诊断和个性化治疗。