Warburg效应对人类视网膜内皮细胞核苷酸稳态的影响及其与增殖性糖尿病视网膜病变的相关性

《Frontiers in Pharmacology》：Impact of the Warburg effect on nucleotide homeostasis in human retinal endothelial cells and its relevance to proliferative diabetic retinopathy

糖尿病视网膜病变（PDR）的代谢机制研究。通过代谢组学和蛋白质组学分析，发现高血糖（HG）与缺氧（Hyp）共同刺激下，视网膜内皮细胞（HRECs）核酸代谢出现紊乱，AMP和ADP水平显著升高，且在PDR患者玻璃体液中得到验证。机制涉及NDP激酶活性降低、核苷酸补救途径增强及Warburg效应驱动。AMP+ADP>0.0062 μM可作为诊断生物标志物，为PDR治疗提供新靶点。

　　糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病引发的一种严重并发症，而增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）则是DR的晚期阶段，常导致视力丧失。尽管在筛查方法和治疗策略方面取得了显著进展，PDR仍然是视力丧失的主要原因之一。本研究旨在探讨高血糖（HG）和缺氧（Hyp）环境下人视网膜内皮细胞（HRECs）的核苷酸代谢变化，并通过患者样本验证这些发现。研究发现，HG和Hyp不仅在体外实验中显著影响HRECs的核苷酸代谢，还在PDR患者的玻璃体样本中观察到类似的代谢异常，特别是腺苷单磷酸（AMP）和腺苷二磷酸（ADP）的积累。这些变化可能为PDR的早期诊断提供新的生物标志物，并揭示核苷酸代谢在PDR发病机制中的关键作用。

### 研究背景

糖尿病的发病率在全球范围内持续上升，预计到2030年，美国将有超过5000万人受到影响。糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病患者常见的微血管并发症，其中约27%的患者会发展为PDR。PDR的主要特征是视网膜新生血管（RNV）的形成，这种异常的血管生长最终会导致视网膜出血和脱离，进而造成视力损害。目前的治疗方法，如激光光凝术和玻璃体腔内抗血管内皮生长因子（VEGF）注射，虽然在一定程度上有效，但也伴随着副作用，如视力下降或视网膜脱离的风险。因此，深入理解PDR的发病机制，尤其是RNV的形成过程，对于开发更有效的治疗策略至关重要。

PDR的发生机制复杂，除了高血糖外，缺氧也被认为是关键因素之一。在PDR中，视网膜毛细血管的非灌注区域逐渐扩大，这一现象与疾病严重程度和RNV风险密切相关。缺氧导致缺氧诱导因子（HIF1/2α）的稳定，进而调控葡萄糖代谢和糖酵解。HIFs的激活不仅促进糖酵解，还可能通过非VEGF途径促进血管生成，例如通过调控红细胞生成素（EPO）和血管生成素（angiopoietins）等信号通路。因此，研究HG和Hyp共同作用下HRECs的代谢变化，有助于揭示PDR中血管生成的潜在机制。

此外，由于PDR在动物模型中难以完全复制，因此需要建立更接近人类病理生理特征的实验系统。本研究采用HG和Hyp联合作用的HRECs模型，通过多组学方法（代谢组学和蛋白质组学）分析核苷酸代谢的变化，并进一步在PDR患者的玻璃体样本中验证这些发现。这种结合体外实验和临床样本的研究方法，有助于揭示PDR的代谢特征，并为临床诊断和治疗提供新思路。

### 研究方法

本研究通过体外培养HRECs，并在不同条件下进行代谢组学和蛋白质组学分析。HRECs在正常条件下培养后，分别暴露于HG、Hyp或两者的组合环境。通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对核苷酸相关代谢物进行定量分析，同时利用蛋白质组学技术评估参与核苷酸代谢的蛋白质表达变化。为了验证体外结果，研究人员还收集了PDR患者和非PDR对照组的玻璃体样本，并通过受试者工作特征（ROC）分析评估核苷酸代谢物作为PDR生物标志物的潜力。

研究中采用的实验设计旨在模拟PDR的病理环境，确保HG和Hyp的双重作用。为维持渗透压平衡，对照组和HG组分别加入25 mM的甘露醇。细胞在这些条件下培养4天后，再暴露于正常氧浓度（21% O?）或低氧环境（2% O?，5% CO?）24小时。通过这些实验条件，研究人员能够观察到HG和Hyp对HRECs代谢的综合影响。

### 研究结果

在体外实验中，HG和Hyp显著影响了HRECs的核苷酸代谢。尽管总的核苷酸相关代谢物水平没有明显变化，但核苷酸前体（如D-核糖-5-磷酸和肌苷单磷酸）的浓度显著升高。这种变化可能与细胞代谢的重新编程有关，特别是在HG和Hyp诱导的糖酵解过程中，细胞倾向于积累核苷酸前体，以支持DNA和RNA的合成，从而促进细胞增殖和血管生成。

在玻璃体样本中，研究人员观察到PDR患者的AMP+ADP浓度显著高于非PDR患者。ROC分析进一步验证了AMP+ADP作为PDR诊断标志物的潜力，其特异性达到87.5%。此外，蛋白质组学分析显示，关键的核苷酸代谢酶如线粒体核苷酸二磷酸激酶（NME4）表达下降，而细胞质中的腺苷激酶（AK1）和多个参与新合成和补救途径的酶则表达上调。这些变化可能与核苷酸前体的积累和三磷酸核苷（NTPs）的减少有关，从而影响内皮细胞的正常功能。

### 机制探讨

研究结果表明，HG和Hyp共同作用下HRECs的代谢变化可能涉及多个机制。首先，线粒体核苷酸二磷酸激酶（NME4）的表达下降可能导致NTP的合成受限，从而促进核苷酸二磷酸（NDPs）的积累。其次，糖酵解的增强可能通过增加NTP酶的活性，加速NTP向NDP的转化。此外，核苷酸前体的合成增加可能是由于HG和Hyp条件下某些关键酶的上调，如PFAS、ADSS2和ATIC等，这些酶参与嘌呤新合成途径，进一步支持NDP的积累。

在嘧啶代谢中，DHODH的下调可能表明新合成途径受到抑制，而补救途径的激活则可能通过UCK2和CMPK1的上调来解释。这些变化可能导致核苷酸代谢的重新分布，从而支持DNA合成和血管生成所需的dNTPs。此外，AMP和ADP的积累可能通过激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）来促进糖酵解，进一步加剧核苷酸代谢失衡。

### 临床意义

AMP+ADP的积累不仅在体外实验中显著，也在PDR患者的玻璃体样本中观察到。这一发现为PDR的早期诊断提供了新的方向，特别是AMP+ADP的特异性较高，可能成为一种有效的生物标志物。此外，研究还指出，核苷酸代谢的改变可能为PDR的治疗策略提供新的靶点，例如通过调控核苷酸代谢酶或抑制糖酵解途径来减少血管生成。

然而，研究也存在一些局限性。例如，体外实验中的样本量可能限制某些分析的统计效力，且玻璃体样本的异质性可能影响结果的解释。因此，未来的研究可以考虑使用更广泛的样本量和更精细的实验设计，如单细胞多组学分析，以进一步明确不同细胞类型在PDR中的代谢贡献。此外，AMP+ADP作为生物标志物的诊断阈值需要在更大的临床样本中进行验证，以确保其在实际应用中的可靠性。

### 结论

综上所述，本研究揭示了HG和Hyp对HRECs核苷酸代谢的深远影响。这些代谢变化可能与PDR的血管生成和病理进展密切相关。AMP+ADP的积累不仅反映了代谢失衡，还可能成为PDR的早期诊断标志物。通过调控核苷酸代谢相关酶或代谢途径，可能为PDR的治疗提供新的策略。未来的研究需要进一步验证这些发现，并探索更广泛的临床应用。